枯草芽孢杆菌芽孢表面展示重组抗原疫苗研究进展

枯草芽孢杆菌芽孢所具有的独特的理化特性及生理特征,使之成为新型的蛋白或酶类药物载体而倍受关注。简介了枯草芽孢杆菌芽孢结构特征,以及诱导机体产生的免疫反应,重点阐述了利用芽孢表面展示技术研制重组外源抗原疫苗,最后对芽孢表面展示外源抗原疫苗的应用前景进行了展望。     

枯草芽孢杆菌表面展示技术用于黏膜疫苗的研究进展

枯草杆菌全名枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),因其优秀的益生特性及芽孢良好的抗逆性而备受研究者青睐,由于芽孢的特殊结构及独特的生理特性,是酶和免疫原等外源蛋白的理想锚定点。采用枯草杆菌进行芽孢表面展示被认为是表达高活性和高稳定性的外源蛋白的方法之一。本文主要对枯草杆菌芽孢表面展示抗原蛋白以生产黏膜疫苗的策略和应用前景进行综述。     

大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建及碱性蛋白酶的表达

构建了一个可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制,并可以在枯草芽孢杆菌中表达外源蛋白的穿梭表达载体pBE2R.该穿梭表达载体是以pBE2为基本骨架,引入来自pWB980质粒的P43强启动子,并在其下游引入嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽构建而成.试验结果表明,该穿梭表达载体pBE2R可以在大肠杆DH5α和枯草芽孢杆菌WB600中稳定存在,并可以使外源蛋白在枯草芽孢杆菌进行分泌表达,同时也为碱性蛋白酶定向改造提供了高通量筛选平台.     

枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子。目前,枯草芽孢杆菌中常用的启动子为组成型、诱导物诱导型、时期特异性及自诱导型。详细介绍枯草芽孢杆菌表达系统以及其常用启动子的优缺点,并对克隆新的启动子的方法做了总结,旨为完善枯草表达系统和工业生产外源蛋白奠定基础。     

枯草芽胞杆菌孢子表面展示外源蛋白的研究

枯草芽胞杆菌孢子表面展示技术是最近十几年新兴的一种外源蛋白固定方法,已在酶学、疫苗学、靶向药物制备、金属污染治理等领域获得了广泛应用。以孢子衣壳蛋白为载体蛋白,已经成功地把许多抗原、酶和其他蛋白展示在孢子外表面。枯草芽胞杆菌孢子衣壳由多种衣壳蛋白组成,但可用做载体蛋白的并不多,且它们的特性不同。综合介绍了枯草芽胞杆菌孢子表面展示外源蛋白这种新型技术的具体机理,及其在国内外各领域应用的研究进展。     

以CotC为分子载体在枯草芽孢杆菌表面展示海藻糖合酶

海藻糖是自然界中普遍存在的一种非还原性双糖,是一种极好的天然干燥剂和保鲜剂。海藻糖合酶能够催化α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖,是生产海藻糖的首选。为获得具有良好展示效果的海藻糖合酶,将其高效稳定的展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面,实验同时分别选取增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和海藻糖合酶(Tres)作为模型蛋白,以来自枯草芽孢杆菌的芽孢衣壳蛋白Cot C作为枯草芽杆菌表面展示的锚定蛋白进行表面展示研究。利用流式细胞仪分析EGFP在芽孢表面展示的情况,结果表明芽孢衣壳蛋白Cot C可以将EGFP固定在芽孢的表面。然后将荧光蛋白基因egfp通过酶切替换为海藻糖合酶基因tres,将重组菌株使用p H7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为30%的麦芽糖在50℃水浴条件下作用2h,反应产物利用HPLC检测,能够检测到海藻糖峰,通过计算得到的酶活为252U/ml。说明海藻糖合酶基因通过与芽孢衣壳蛋白Cot C融合后可被展示在芽孢的表面。     

无性繁殖芽孢杆菌和链霉菌用的运载体

运载体是由一个编码某一核糖体特异结合位点的DNA序列,来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Veg。促进子和一个编码所需蛋白的基因组构起来的,许多芽孢杆菌和链霉菌就利用了这样一些运载体生产出了外源蛋白质。这些运载体的优点,形体小,全能性表达。利用枯草芽孢杆菌和链霉菌代替大肠     

以CotX为分子载体在枯草芽胞杆菌芽胞表面展示绿色荧光蛋白

芽胞衣壳蛋白CotB、CotC、CotG等可作为芽胞表面展示外源蛋白的分子载体,制备口服重组疫苗或具有催化活性的重组酶。CotX为枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis芽胞衣壳中的另一种结构蛋白。为证明CotX能否作为分子载体将外源蛋白展示在芽胞表面,本研究将cotX基因与绿色荧光蛋白基因gfp的编码序列进行基因重组,构建融合表达CotX-GFP的整合型重组质粒,将该质粒转化枯草芽胞杆菌,筛选重组菌株并诱导产生芽胞,观察到重组芽胞表面具有GFP绿色荧光。结果表明枯草芽胞杆菌的芽胞衣壳蛋白CotX位于芽胞衣壳外层,可作为芽胞表面展示外源蛋白的载体分子。     

枯草芽孢杆菌感受态研究新进展

在枯草芽孢杆菌中,感受态的形成受到一种二元信号转导系统的调节,这种系统对胞外的感受态信息素浓度作出感应而激活晚期感受态基因的表达。各种晚期感受态蛋白分别负责外源DNA的吸附、吸收和内源化,它们共同构成了DNA的运输系统。初步探讨了枯草芽孢杆菌感受态调节在细胞生长和进化中的意义。     

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究

为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进.用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DBl342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响.结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DBl342的转化率为750 CFU/μg/DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/xg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg/DNA.根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内.     

一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法

脂肽(Lipopeptide)是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物产生的一类具有较强表面活性的生物表面活性剂.枯革杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(afp)是枯草芽孢杆菌中参与脂肽代谢的功能性基因.采用sfp基因PCR对从环境中得到的一组产生表面活性剂的微生物进行筛选,结合Tricine-SDS-PAGE电泳对PCR结果呈阳性的菌蛛的代谢粗初提物进行检测,初步鉴定得到两株枯草芽孢杆菌.进一步利用16S rDNA序列的系统发育学分析确定这两种菌株为枯草芽孢杆菌,并利用TLC、HPLC鉴定其产物为脂肽类表面活性剂,从而建立了一套快速分离检测产生脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌方法.     

枯草芽孢杆菌微生态制剂发酵研究进展

微生态制剂是饲用抗生素的绿色有效替代品。枯草芽孢杆菌在逆境中可形成抗逆性强的芽孢,在生产和应用过程中保持高活性,是一种高效的微生态制剂菌种。提高枯草芽孢杆菌活菌数及芽孢率是保证微生态制剂产品质量的关键。本文综述了枯草芽孢杆菌芽孢形成的分子生物学机制及影响芽孢形成的重要因素,进一步比较枯草芽孢杆菌微生态制剂不同发酵方式的特点,重点阐述了提高枯草芽孢杆菌有效生物量的工艺优化,最后介绍了枯草芽孢杆菌微生态制剂的应用,并对将来研究思路进行了讨论。     

β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

为检测本课题组构建的枯草芽孢杆菌分泌表达载体pGPST中启动子和信号肽的活性,将β-半乳糖苷酶基因插入表达载体的多克隆位点,构建含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pGPST-lacZ,重组质粒转化枯草芽孢杆菌,分别测定液体培养基中上清液和菌体沉淀中β-半乳糖苷酶的活性。培养上清液中的酶活在22h达到峰值,约为26mU/mL,之后开始下降;菌体沉淀中的酶活在14h最高,达6mU/mL,而阴性对照pGPST没有检测到酶活性。结果表明分泌型表达载体中的启动子和信号肽具有较好的活性,能实现异源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。本试验为该表达载体的进一步研究和应用提供重要的数据资料,也为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供参考资料。该载体将在研究外源基因在枯草芽孢杆菌中表达发挥重要作用。     

枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌中的研究进展

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌中比较具应用潜力的菌种之一。近年来国内外对于芽孢杆菌各方面应用的研究日益增多,枯草芽孢杆菌作为一种生防细菌越来越引起人们的关注。主要综述了枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌生物防治领域的研究进展,阐述了枯草芽孢杆菌的控病作用机制,包括竞争作用、拮抗作用、溶茵作用、诱导植物产生抗性及促进植物生长5个方面。简要介绍了枯草芽孢杆菌及其制剂在国内外的应用情况及在植物病害防治应用中存在的问题、解决措施及发展前景。     

木糖酸氧化途径在枯草芽孢杆菌的构建及转化乙醇酸的研究

通过过表达外源基因,旨在获得一株生产乙醇酸的食品安全菌。通过构建质粒在枯草芽孢杆菌A164S中过表达来自大肠杆菌的木糖酸降解途径,并用高效液相色谱对产物进行检测。诱导质粒表达后,重组枯草芽孢杆菌菌株成功地将木糖酸转化为乙醇酸,摩尔转化率达到42.54%。同时,枯草芽孢杆菌自身因存在非特异的醛缩酶及乙二醛脱氢酶,能够在只表达木糖酸脱水酶YjhG的情况下获得生物转化木糖酸的能力。成功构建了一株可利用木糖酸生产乙醇酸的枯草芽孢杆菌,并发现了可能的YjhH同工酶的存在。     

基于全基因组序列比对的枯草芽孢杆菌噬菌体侵染能力分析

目前,在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中已报道数量众多的枯草芽孢杆菌及其噬菌体的全基因组序列,这为我们利用全基因组比对手段研究枯草芽孢杆菌噬菌体的侵染能力提供了数据基础。本研究从NCBI基因组数据库中下载具有完整序列的枯草芽孢杆菌及噬菌体的基因组及相应的蛋白质序列,利用BLAST软件进行基因组序列比对,得出枯草芽孢杆菌与噬菌体之间的关系。通过利用R语言等软件对噬菌体侵染枯草芽孢杆菌的能力进行分析。然后利用Clustalx和Treeview软件构建进化树,得出枯草芽孢杆菌之间的亲缘性关系,最后对枯草芽孢杆菌蛋白质进行COG注释。结果表明:在65株枯草芽孢杆菌噬菌体中,Bacillus_phage_SPBc2和Bacillus_phage_ph IS3501的侵染能力最强,而Bacillus_phage_phi AGATE等3株噬菌体的侵染能力较弱。在37株枯草芽孢杆菌中Bacillus subtilis ATCC 49760的易感性较强,Bacillus subtilis RO-NN-1等8株对枯草芽孢杆菌噬菌体的抗性较强。本研究利用基因组比对的方法对枯草芽孢杆菌噬菌体侵染宿主的能力以及枯草芽孢杆的蛋白质功能进行了分析,为后续进一步研究枯草芽孢杆菌噬菌体侵染能力及其蛋白质功能提供参考。     

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示研究进展

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示技术是把枯草芽胞杆菌作为芽胞表面展示的宿主来展示目的蛋白的一种技术。该技术不仅具备芽胞表面展示技术可展示分子量较大的目的蛋白、目的蛋白无需跨膜及芽胞的极强抗逆性等特点外,同时由于该技术的宿主菌--枯草芽胞杆菌的分子生物学信息研究得比较清楚、安全性高而被广泛应用。介绍了枯草芽胞杆菌表面展示近10年在生产疫苗和固定化酶方面的进展,并对如何提高表面展示目的蛋白的产量做了简要概述。     

枯草芽孢杆菌无标记遗传操作技术研究进展

枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌的模式生物,长期以来在代谢工程和工业微生物领域扮演重要角色。枯草芽孢杆菌无标记遗传操作技术对后基因组时代的基因功能研究和菌株生理特性的改造起着关键作用。综述枯草芽孢杆菌无标记遗传操作所使用的负筛选标记基因,总结目前主流的无标记遗传操作的策略,并提出枯草芽孢杆菌无标记遗传操作技术面临的主要问题和发展方向。     

枯草芽孢杆菌用于外源蛋白质生产和分泌的可能性

成功地利用枯草芽孢杆菌分泌外源基因产物,需要一个缺失胞外蛋白酶的寄主,需要创造遗传调控外源基因在生长期间表达的因子和营养条件,还需要进一步了解寄主的分泌机制以提高其分泌效率。     

地衣芽孢杆菌WL1菌株质粒的初步研究

地衣芽孢杆菌是一种较为重要的工业生产菌,现在发现它的染色体DNA与枯草芽孢杆菌有24％的同源性,用地衣芽孢杆菌噬菌体SP-15进行转导和其它方法建立了它的遗传图,发现与枯草芽孢杆菌的遗传图也十分相近。由此可见,它不仅是一个很有开发潜力的工业生产菌,而且也可能成为重要的遗传学材料。目前,在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌之间的基因转