基于枯草芽孢杆菌产物应用的基因组精简研究进展

枯草芽孢杆菌代谢产物众多,具有很强的应用开发前景,在工业上广泛应用。本文总结了聚谷氨酸、纳豆激酶和维生素K2三种热点代谢产物及其在医药、食品、农业上的应用。枯草芽孢杆菌是常用的基因工程菌,对其进行遗传改造的方法较多。本文综述了同源重组、位点特异性重组和CRISPR/Cas9三种基因组精简手段,总结了困扰枯草芽孢杆菌代谢产物开发应用与基因组精简的问题,推断未来发展的方向,期望推动枯草芽孢杆菌的开发与应用。     

一株枯草芽孢杆菌噬菌体的生物学特性分析及抗性菌株的诱变筛选

枯草芽孢杆菌工业生产发酵过程中经常出现噬菌体污染的问题,分离筛选以枯草芽孢杆菌为宿主菌的噬菌体,分析其生物学特性并采用自发突变方法筛选噬菌体抗性菌株。以枯草芽孢杆菌KC-260为宿主菌,从车间异常发酵液中分离纯化得到一株噬菌体,将其命名为P260,富集培养后测定效价,对其热稳定性、最佳感染复数、宿主范围、抑制剂和消毒剂耐受性等生物学特性进行了研究。为防治噬菌体P260的污染,利用自发突变的方法筛选对噬菌体P260有抗性的枯草芽孢杆菌突变菌。结果显示,分离纯化得到一株效价为3.45×1010 PFU/m L的噬菌体P260,该噬菌体具有一定的宿主专一性,对凝结芽孢杆菌和短小芽孢杆菌不敏感。噬菌体P260在高温条件下很容易失活,不耐热,70℃处理15 min存活率下降极为明显;25 mg/L的Cl O2对P260有极强的杀灭作用;0.5%的草酸铵和柠檬酸铵对该噬菌体有一定的抑制作用。P260感染宿主菌的最佳感染复数为0.01,增殖的潜伏期为15 min,45 min进入裂解期。通过自发突变的方法获得了抗噬菌体菌株ZF-260,发酵过程中添加噬菌体后ZF-260的生长不受影响,说明ZF-260是一株可以抗噬菌体P260的优良菌株。研究了噬菌体P260的生物学特性,获得了遗传稳定且活菌数高的抗性菌株ZF-260。     

枯草芽孢杆菌表达和分泌异源蛋白的研究进展

枯草芽孢杆菌是一种广泛应用于基础研究和工业生产的重要模式菌株,具有无致病性、蛋白分泌能力强、遗传背景清晰等多种优势,是生产异源蛋白的理想宿主。目前已有诸多异源蛋白在枯草芽孢杆菌中实现表达和分泌,其中包括淀粉酶、β-半乳糖苷酶和蛋白酶等有价值的工业酶。本文从异源蛋白表达和分泌的关键步骤出发,总结了枯草芽孢杆菌生产异源蛋白的传统策略和最新技术。除此之外,分析了当前研究存在的瓶颈并对如何提高异源蛋白产量提出了新的建议和策略。     

枯草芽孢杆菌微生态制剂发酵研究进展

微生态制剂是饲用抗生素的绿色有效替代品。枯草芽孢杆菌在逆境中可形成抗逆性强的芽孢,在生产和应用过程中保持高活性,是一种高效的微生态制剂菌种。提高枯草芽孢杆菌活菌数及芽孢率是保证微生态制剂产品质量的关键。本文综述了枯草芽孢杆菌芽孢形成的分子生物学机制及影响芽孢形成的重要因素,进一步比较枯草芽孢杆菌微生态制剂不同发酵方式的特点,重点阐述了提高枯草芽孢杆菌有效生物量的工艺优化,最后介绍了枯草芽孢杆菌微生态制剂的应用,并对将来研究思路进行了讨论。     

加强表达6-磷酸果糖激酶提高Bacillus subtilis乙偶姻合成效率

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要胞外产物,它是一种广泛使用的食用香精,同时也可作为重要的化学中间体,因此提高枯草芽孢杆菌乙偶姻的产量和生产效率有重要意义。本研究克隆了编码枯草芽孢杆菌6-磷酸果糖激酶(PFKA)和丙酮酸激酶(PK)的编码基因pfk A和py K,并分别将其在高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌BM(敲除了2,3-丁二醇脱氢酶的编码基因bdh A)中过量表达。结果表明过量表达PFKA或者PK能有效提高糖酵解速率以及发酵过程的生物量,并且过量表达PFKA与过量表达PK相比更有利于乙偶姻的合成。在5 L发酵罐上对工程菌进行发酵实验发现,经底物流加发酵,乙偶姻产量达到66.8 g/L,生产效率达到0.74 g·(L·h)-1。本研究为利用枯草芽孢杆菌作为细胞工厂生产相关化合物有重要的借鉴意义。     

枯草芽孢杆菌对几种植物病原真菌的抑菌活性

枯草芽孢杆菌是目前国内外比较具有应用潜力的生防菌种之一。本文主要研究了枯草芽孢杆菌菌液对几种植物病原菌的菌丝抑制试验、菌丝形态影响试验以及分生孢子萌发抑制试验,了解枯草芽孢杆菌菌液对尖孢镰刀菌古巴专化型、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、麦根腐平脐蠕孢、尖孢镰刀菌的抑制作用及抑菌机理。结果显示:枯草芽孢杆菌菌液对6种病原真菌的菌丝形态、菌丝生长、产孢和分生孢子萌发都有明显的破坏或抑制作用。用枯草芽孢杆菌菌液处理尖孢镰刀菌古巴专化型、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、麦根腐平脐蠕孢、尖孢镰刀菌后,在PDA培养基上均形成了明显的抑菌圈,直径达3. 00 cm左右;菌液处理后分生孢子的萌发率仅30%左右。显微镜观察发现,处理组菌丝生长异常,体表凹凸不平,局部膨大,分枝变多,原生质体外泄。研究表明枯草芽孢杆菌菌株对尖孢镰刀菌古巴专化型、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、麦根腐平脐蠕孢和尖孢镰刀菌有良好的抑制作用,并且可以有效控制尖孢镰刀菌古巴专化型、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、麦根腐平脐蠕孢和尖孢镰刀菌病害的发生。     

枯草芽孢杆菌表达与调控工具相关研究进展

枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性模式微生物,由于其清晰的遗传背景、高效的分泌能力以及简单的培养条件等优势被广泛的应用于生物技术产业。近年来,随着代谢工程与合成生物学的发展,枯草芽孢杆菌相关表达系统与调控工具研究也取得了很大进展。围绕枯草芽孢杆菌动态调控工具的研究进展,分别从转录水平调控和转录后水平调控两个层面上进行综述,并对调控元件在生物技术中的应用进行了讨论。最后,对未来枯草芽孢杆菌表达与调控工具的发展进行了展望。     

海水养殖系统中37株枯草芽孢杆菌生理代谢、遗传特性及抑菌效果差异分析

【背景】由水产致病菌导致的病害不断暴发,寻找安全有效的抗生素替代品是目前生产的迫切需求。人们通常过于关注益生菌效应,而对其安全性评价重视度不够。【目的】分析我国海水养殖系统中不同来源枯草芽孢杆菌菌株的表型及遗传特征,并寻找绿色安全且具有多重抑菌作用的菌株。【方法】以2009-2021年从我国海水养殖系统中分离的37株枯草芽孢杆菌为对象,利用纸片扩散法(K-B法)检测其对不同抗生素的抗性;利用培养基平板法测定淀粉酶、蛋白酶和溶血能力;通过PCR方法检测枯草芽孢杆菌溶血相关基因携带风险;采用牛津杯法测定其对副溶血弧菌、溶藻弧菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌和假交替单胞菌等6种病原菌的抑菌作用;并对候选益生性枯草芽孢杆菌的安全性进行评估。【结果】药敏检测结果显示,37株枯草芽孢杆菌对甲氧苄啶、吡哌酸、链霉素表现出强耐药性,对磺胺嘧啶表现出中等耐药,对头孢噻肟、环丙沙星、舒巴坦的耐药率低,对克拉霉素、诺氟沙星、氟苯尼考、氟甲喹、复方新诺明、四环素表现为完全敏感。蛋白酶、淀粉酶活性测试结果显示,37株枯草芽孢杆菌能不同程度地水解酪蛋白和淀粉。溶血性测试结果显示,37株枯草芽孢杆菌中有4株出现溶血现象,而8个溶血相关基因在37株枯草芽孢杆菌中均有检出,溶血表型与检测基因关联分析表明,产生溶血现象的菌株与其溶血基因携带间无直接相关性。抑菌试验分析表明,37株枯草芽孢杆菌均对2种及以上病原菌有抑制作用,对6种病原菌均具有良好抑菌作用的有2株(菌株Bs4和Bs7)。对凡纳滨对虾的安全试验表明,菌株Bs4对凡纳滨对虾具有高安全性,7 d对虾存活率为100%。【结论】通过对37株枯草芽孢杆菌生理代谢表型、遗传特性及病原拮抗特性进行比较分析,揭示了我国海水养殖系统中枯草芽孢杆菌具有多元化的表型及遗传特征,并筛选出一株生态安全且具有多重抑菌活性的益生性枯草芽孢杆菌,为水产养殖病害防控、开发抑菌类微生态制剂及水产养殖行业健康绿色发展提供了理论基础和技术支撑。     

葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵条件优化

为了研究葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达,笔者从枯草芽孢杆菌中克隆得到带有自身信号肽的葡萄糖醛酸木聚糖酶基因,将其构建到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒中,转化入枯草芽孢杆菌WB800,得到重组菌。通过发酵条件以及培养基成分优化,重组菌中葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活达到76.0 U/mL,约为优化前产酶量的5.4倍。葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中实现高效异源表达,为其进一步的实际应用奠定了基础。     

细胞型朊蛋白抑菌活性的初步探索

目的:研究细胞型朊蛋白(PrP~c)有无抑菌活性。方法:把Pr Pc分别与金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌等5种菌孵育一定时间,然后用碘化丙锭对上述5种样品染色后采用流式细胞仪检测各样品的荧光信号。结果:通过对流式细胞仪的荧光信号进行分析,发现PrP~c对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性,而另外3种菌的样品没有检测到荧光信号的增强,亦即PrP~c对这3种菌无抑菌活性。结论:细胞型朊蛋白有一定的抑菌活性,有望成为一种新型的抗菌肽。     

肌苷生产菌枯草芽孢杆菌ATCC 13952的全基因组测序及序列分析

摘要:【目的】枯草芽孢杆菌ATCC 13952是一株肌苷工业生产菌株。为深入研究ATCC 13952菌株积累肌苷的分子机制以及为进一步分子育种研究提供序列背景信息,有必要解析ATCC 13952菌株的基因组序列信息。【方法】本研究采用高通量测序和Sanger测序相结合对ATCC 13952菌株进行全基因组测序,然后使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、GO/COG 聚类分析、共线性分析等。【结果】枯草芽孢杆菌ATCC 13952整个基因组大小为3876276 bp,GC含量为45.8%,序列已提交至GenBank 数据库,登录号为CP009748。比较基因组及嘌呤代谢相关基因分析结果显示:枯草芽孢杆菌ATCC 13952与其他几株芽孢杆菌具有较好的基因组共线性关系,嘌呤代谢相关基因编码的蛋白与标准菌株比较发生了一些缺失和突变。【结论】本研究首次报道了一株肌苷生产菌枯草芽孢杆菌ATCC 13952的全基因组序列,分析了基因组基本特征,初步探讨了该菌株积累肌苷的分子机制,为后续的进一步分子育种提供了理论基础。     

一株拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌的初步研究

目的 对一株具有拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌的特性进行研究.方法 采用菌落法测试多株芽孢杆菌对18种不同来源致病菌的抑制效应,并对其中一株可拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌(KC株)进行鉴定和电泳分析.结果 该芽孢杆菌(KC株)经生理生化以及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌;KC株对人源、鱼源、畜禽源和鸡粪源的多重耐药菌有不同程度的拮抗效应;SDS-PAGE分析提示,35 kD左右的分泌蛋白可能参与了KC株的抑菌活性.结论 具有拮抗多重耐药菌的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌,且该菌分泌的35 kD蛋白可能参与抑菌活性.     

玉米根系内生细菌种群及动态分析

2000-2002年,先后对辽宁省14个玉米主栽品种进行了根系内主要细菌种群分析．结果表明．玉米内生细菌的主要种群为芽孢杆菌属(Bucillus spp．),此外还包括肠杆菌属、沙雷氏杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属和棍状杆菌属．其中Bacillus分布最广,已鉴定出8个种,包括枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌．Bacillusspp．总量占根系内生细菌总量比苗期和成株期分别为75．5％和76．6％．内生细菌在不同玉米品种和不同生育期之间存在程度不同的差异．研究发现,品种的遗传背景与其内生细菌的种类和数量显著相关．     

枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子。目前,枯草芽孢杆菌中常用的启动子为组成型、诱导物诱导型、时期特异性及自诱导型。详细介绍枯草芽孢杆菌表达系统以及其常用启动子的优缺点,并对克隆新的启动子的方法做了总结,旨为完善枯草表达系统和工业生产外源蛋白奠定基础。     

抗MRSA菌株B2的鉴定和活性检测研究

目的寻找新型抗MRSA菌株并进行鉴定。方法:通过传统的形态学、生理生化鉴定,并基于16S rDNA的进一步分析,进行活性检测。结论:通过活性检测,发现本实验室分离到的菌株B2具有抑制MRSA生长活性,通过传统的形态学、生理生化鉴定,发现它与芽孢杆菌特征相符,基于16S rDNA的进一步分析表明,B2菌株与枯草芽孢杆菌有高度同源性,故鉴定为枯草芽孢杆菌B2。     

一株细薄星芒海绵细菌的抗菌活性与分类学研究

采用平板涂布法从我国南海细薄星芒海绵分离得到一株细菌A72,以大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、黑曲霉、白假丝酵母、宛氏拟青霉7种指标菌对A72的抗菌活性进行了研究,同时采用形态学观察、生理生化分析与16S rDNA同源性与系统发育分析进行种属鉴定。研究发现A72对于枯草芽孢杆菌等具有显著的活性,初步确认A72为粪产碱杆菌。     

海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建

通过基因重组等技术构建重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌,并对此基因工程菌进行生长曲线的测定和稳定性分析。结果表明,海参溶菌酶基因特异引物在400 bp处扩增出特异性条带,与预期的海参溶菌酶基因大小一致;重组表达质粒pHT43-SjLys经双酶切验证得8 000 bp和400 bp左右的片段;重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌与原始菌株WB600相比生长趋势基本一致,外源基因的插入对菌体的生理代谢未造成太大影响;在无选择压力的条件下,重组质粒的稳定性良好,连续传5次后的遗传稳定性为94%,并且提取质粒和双酶切验证后发现工程菌没有发现重排或丢失现象。表明重组海参溶菌酶基因工程菌pHT43-SjLys/WB600构建成功。     

一株种内拮抗的海洋枯草芽孢杆菌的分离与鉴定

从中国东海海域筛选到好氧耐盐菌株A01,此菌株显示出抗枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的活性采取对该菌株形态特征、培养特征、生理生化特征和遗传特性进行研究的方法,结果表明此菌株与枯草芽孢仟菌（Bacillus subitilis）的特征一致;将此菌株的16S rDNA序列在GenBank中进行序列比对,结果亦显示其与Bacillus subitilis的16SrDNA的序列片段的相似性为100％;以相似性为基础构建系统发育树,分析表明该菌株与Bacillus subitilis同源关系最近最终得出结论为菌株A01是一株来源于海洋的枯草芽孢杆菌,且具有种内拮抗的特性。     

日本利用枯草菌以每升210毫克的产率分泌生产人生长激素

日本三井东压化学公司通过对枯草菌(Bacillus subtilis)的基因操作,大量分泌生产人生长激素(hGH)成功。每升分泌量达210毫克,相当于菌体外蛋白的25%。这是很接近工业生产水平的产量。在1986年12月2日于大阪召开的《第四次下一代基础技术讨论会》上发表了这项研究成果。这次研究成功,关键的一着是得到了更低地抑制了蛋白酶活性的菌株。到目前为止,三井东压化学公司所开发的载体,是具有与蛋白酶工业生产菌枯草菌近缘的解淀粉芽孢杆菌     

木糖酸氧化途径在枯草芽孢杆菌的构建及转化乙醇酸的研究

通过过表达外源基因,旨在获得一株生产乙醇酸的食品安全菌。通过构建质粒在枯草芽孢杆菌A164S中过表达来自大肠杆菌的木糖酸降解途径,并用高效液相色谱对产物进行检测。诱导质粒表达后,重组枯草芽孢杆菌菌株成功地将木糖酸转化为乙醇酸,摩尔转化率达到42.54%。同时,枯草芽孢杆菌自身因存在非特异的醛缩酶及乙二醛脱氢酶,能够在只表达木糖酸脱水酶YjhG的情况下获得生物转化木糖酸的能力。成功构建了一株可利用木糖酸生产乙醇酸的枯草芽孢杆菌,并发现了可能的YjhH同工酶的存在。