地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。     

细菌感受态细胞摄取和分泌DNA的相关性研究I.含有质粒的枯草芽孢杆菌自然感受态缺陷突变株的诱变和分离

以携带ｐＵＢ１１０质粒的枯草芽孢杆菌ＢＲ１５１菌株为出发菌株,利用亚硝基胍作诱变剂,直接在ＬＢ平板上进行诱变。从２９４９个菌落中筛选出一个转化频率低于出发菌株２～３个数量级的突变株,并对其营养缺陷型、ＵＶ的敏感性及Ｋｍ抗性和质粒进行了检测,确证其转化能力降低为自然感受态缺陷而非营养缺陷型的改变或重组缺陷所致     

电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ-内毒素基因导入野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导入几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数,计算出转化效率为10~1—10~4转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ－内毒素基因导人野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导人几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数t计算出转化效率为10¹一10¹转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

不同信号肽及分子伴侣对中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的影响

通过筛选5个不同的信号肽基因(AmyE、AprE、NprE、SacB、YncM)代替对照质粒pHT43-npr上原始的信号肽基因,整合2个不同的分子伴侣(PrsA、DnaK)到pHT43-npr质粒上,构建重组质粒并转化到枯草芽孢杆菌WB800N中进行诱导表达。结果表明,构建了5株信号肽重组菌株,通过牛奶平板验证无明显水解圈,通过酶活性比较,5株重组菌株中性蛋白酶活性均显著低于对照菌株;成功构建了2株整合分子伴侣的重组菌株,通过牛奶平板验证有水解圈,通过酶活性比较,两株菌株均表达中性蛋白酶,其中重组菌株WB800N/pHT43-npr-PrsA产蛋白酶活性比对照菌株WB800N/pHT43-npr提高了23%,重组菌株WB800N/pHT43-npr-DnaK产蛋白酶活性比对照菌株提高了33%。     

细菌感受态细胞摄取和分泌DNA的相关性研究① I. 含有质粒的枯草芽孢杆菌自然感受态缺陷突变株的诱变和分离

以携带pUB110质粒的枯草芽孢杆菌BR151菌株为出发菌株,利用亚硝基胍作诱变剂,直接在LB平板上进行诱变。从2949个菌落中筛选出一个转化频率低于出发菌株2～3个数量级的突变株,并对其营养缺陷型、UV的敏感性及Km抗性和质粒进行了检测,确证其转化能力降低为自然感受态缺陷而非营养缺陷型的改变或重组缺陷所致。 Abstract　Natural competence-deficient mutant of Bacillus subtilis　BR151, which carries plasmid pUB110, was obtained by nitrosoguanidine mutagenesis on solid medium. From 2949 clones, a mutant, the transformation frequency of which is 102～103　times lower than that of the control, was obtained and tested for the changes of trophic type, resistance to Km, plasmid and sensitivity to UV. The results indicate the reduction of transformation frequency is due to competence-deficient mutation.     

葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵条件优化

为了研究葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达,笔者从枯草芽孢杆菌中克隆得到带有自身信号肽的葡萄糖醛酸木聚糖酶基因,将其构建到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒中,转化入枯草芽孢杆菌WB800,得到重组菌。通过发酵条件以及培养基成分优化,重组菌中葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活达到76.0 U/mL,约为优化前产酶量的5.4倍。葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中实现高效异源表达,为其进一步的实际应用奠定了基础。     

解淀粉芽孢杆菌赖氨酸-3基因在枯草芽孢杆菌中的克隆

限制性核酸内切酶EcoRI酶切解淀粉芽孢杆菌ASl.1099染色体DNA和质粒pUB lloDNA,T4 DNA连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51(trpC2痢“B5 ly.f3 Neo')感受态细胞。用选择性培养基两次筛选,得到Neo‘和与BR 151 lys3营养缺陷突变互补的菌落。用快速测定质粒的方法检查,其中有13株转化子带有大小相同的重组质粒。分离其中l株转化子BRl51-29的重组质粒pB--L29 DNA,再次转化BRl51感受态细胞和原生质体。测定第二次得到的转化子性状,均与转化子B1~151-29相同。琼脂糖曩胶电泳检查这些转化子的质粒,其分子大小也与t组质粒pB--L29相同。以上试验证明,重组质粒pB--L29是由pUBll0和解淀粉芽孢杆蕾的咖3基因片段构成的。根据琼脂糖凝胶电泳测定pB--L29的分子量约为5.0kb,推断出l~,J3基因片段约为O.5kb。     

枯草芽孢杆菌产胞苷的初步研究

目的:通过对野生型枯草芽孢杆菌NO122的诱变筛选,选育出胞苷产生菌株。方法:以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株进行紫外线、硫酸二乙酯诱变,经3-脱杂氮尿嘧啶、5-氟胞苷结构类似物平板定向筛选产胞苷突变株;研究碳源、氮源、温度、初始pH值等发酵条件对该突变菌株产胞苷的影响。结果:经诱变传代后得到突变株TZM1012,该突变株在发酵温度37℃、初始pH7.2、摇床转速220r/min的条件下,摇瓶发酵72h,发酵液中的胞苷可达1.873g/L,并具有较好的遗传稳定性。结论:获得产胞苷生产菌株,并具有较好的遗传稳定性。     

木糖酸氧化途径在枯草芽孢杆菌的构建及转化乙醇酸的研究

通过过表达外源基因,旨在获得一株生产乙醇酸的食品安全菌。通过构建质粒在枯草芽孢杆菌A164S中过表达来自大肠杆菌的木糖酸降解途径,并用高效液相色谱对产物进行检测。诱导质粒表达后,重组枯草芽孢杆菌菌株成功地将木糖酸转化为乙醇酸,摩尔转化率达到42.54%。同时,枯草芽孢杆菌自身因存在非特异的醛缩酶及乙二醛脱氢酶,能够在只表达木糖酸脱水酶YjhG的情况下获得生物转化木糖酸的能力。成功构建了一株可利用木糖酸生产乙醇酸的枯草芽孢杆菌,并发现了可能的YjhH同工酶的存在。