菊花转抗虫基因植株的PCR快速鉴定

华中农业大学园艺与林学学院蒋细旺和包满球教授用PCR法快速鉴定了菊花转抗虫基因植株。他们对经过卡那霉素抗性筛选所得的菊花转苏云金芽孢杆菌蛋白Bt基因和转雪花莲外源凝集素GNA基因所得的抗性植株,利用改良SDS法提取菊花DNA,然后利用NPTII引物对6个菊花品种的抗性植株所得出的DNA进行PCR扩增,发现了符合NPTII基因片段大小的亮带,初步证实获得了转Bt基因和转GNA基因的菊花植株。     

转基因棉花Bt毒蛋白的表达及其生态学效应

苏云金杆菌毒蛋白 (Bacillusthuringiensisgtoxicprotein)基因导入棉花植株后获得的转Bt棉可以特异性地毒杀棉铃虫及鳞翅目的一些其它害虫 ,有效地保护棉花植株不受此类棉花害虫的危害。Bt毒蛋白在棉花植株中的表达受一些内外界因素的影响而呈明显的时空变化。转Bt棉除了严重影响靶标害虫自身外 ,还能对其它一些非靶标昆虫和环境产生影响。另外 ,该文还对害虫对Bt棉的抗性以及防止害虫产生抗性的治理对策进行了综述     

转抗虫基因植物生态安全性研究进展

转抗虫基因植物如Bt棉花等已在美国、中国和澳大利亚等国家大规模商业化种植 ,有关转抗虫基因植物潜在的生态风险已引起广泛的关注。该文综述了转抗虫基因植物研究应用现状与安全性研究进展。主要内容包括 :转抗虫基因植物的种类及其对靶标害虫的抗性 ,对非靶标害虫和天敌发生的影响 ,对农田生态系统生物多样性的影响 ,靶标昆虫的抗性治理及转抗虫基因植物的基因漂移等     

表达Osmotin蛋白的转基因马铃薯对晚疫病的抗性分析

将缺失C端信号肽序列的Osmotin基因和在第96位氨基酸处发生琥珀突变的Osmotin基因置于CaMV双35S启动子驱动下，转化马铃薯，获得NPTII抗性植株。经对20株NPTII抗性植株的Southern检测和对55株NPTII抗性植株的Nouthern分析，证实了Osmotin基因的插入和转录。对21株转Osmotin基因和17株转琥珀突变Osmotin基因植株的抗病性测定，分别筛选出8株和10株抗病性与非转基因植株有显著差异(α=0.05)的转基因植株。对8株转Osmotin基因植株的Dot blotELISA和Western杂交分析，证明Osmotin蛋白胞外分泌能够赋予转基因植株叶片抗晚疫病的能力，研究结果暗示Osmotin蛋白具有抑菌活性的部位可能位于其N-端。     

转基因棉花主要靶标害虫的抗性发展及抗性治理策略研究

转基因棉花的大面积种植有效的控制了棉铃虫Helicoverpa armigera、红铃虫Pectinophora gossypiella 等靶标害虫的危害,然而抗性监测结果显示,转Bt基因棉田的棉铃虫耐受性正逐年提高,抗性问题已成为影响持续利用转Bt基因棉花的主要因素,发展新的转基因棉花势在必行.新的基因或蛋白的选择应以对靶标害虫高效、不易产生抗性,且与现在广泛应用的基因或蛋白无交互抗性为原则.本文综述了转Bt基因棉花的主要靶标害虫对Bt抗性的研究进展,及其与新抗虫转基因棉花的关系,并讨论了抗性治理策略的发展历程.     

甜菜（Beta vulearis L．）叶绿体转化体系建立及抗虫和抗除草剂植株的获得

为建立外源基因甜菜叶绿体转化体系,利用分子生物学方法构建了包含有编码苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因Bt crylAc和编码膦丝菌素乙酰转移酶基因bar的甜菜叶绿体转化载体pSKARBt／bar,以甜菜叶绿体基因组中atpB／rbcL做同源片段,以甜菜叶绿体16S启动子和终止子为调控基因,以bar基因为筛选标记基因．基因枪法转化甜菜叶柄,经筛选获得抗性转基因植株．对转基因植株进行外源基因Bt crylAc和bar的PCR检测、DNA印迹分析,结果表明：外源基因Bt crylAc和bar确已导入到甜菜叶绿体基因组中．转基因植株除草剂抗性鉴定及其离体叶片虫试鉴定结果表明：转基因植株具有较强的杀虫活性和抗除草剂特性,表达了相应的蛋白质．研究结果还表明：bar基因在植物叶绿体转化中,既可以用作抗性基因,又可用作转化体筛选的标记基因．建立了甜菜叶绿体转化体系．     

Bt杀虫剂研究进展

概述了害虫对转苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis,简称Bt）抗虫基因植物的行为学反应、Bt毒素基因的鉴定和定位、Bt辅助蛋白、昆虫对Bt毒素的抗性机理、天敌与转Bt基因抗虫植物的协同控害作用、Bt安全性方面的研究现状,提出了今后的研究方向。     

基因枪法介导GNA基因遗传转化甘蔗的研究

目的:将含有雪花莲外源凝集素(GNA)基因的植物表达载体用基因枪法分别导入一个果蔗和一个糖蔗品种中,以期获得转基因植株。方法:将GNA基因插入到植物表达载体上,构建出不同选择标记、不同启动子的表达载体,并用基因枪法将之导入甘蔗胚性愈伤组织,分别在G418、PPT和Hyg的选择压力下,筛选抗性植株,并进行分子杂交鉴定。结果:通过斑点杂交和PCR-Southern杂交证明GNA基因已整合到甘蔗基因组中。结论:用基因枪法成功获得了含有GNA基因的甘蔗转化株,为培育抗甘蔗绵蚜(Ceratovacuna lanigeraZehnther)的新品种提供了基础。     

甜菜(Beta vulgaris L.)叶绿体转化体系建立及抗虫和抗除草剂植株的获得

为建立外源基因甜菜叶绿体转化体系,利用分子生物学方法构建了包含有编码苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因By crylAc 和编码膦丝菌素乙酰转移酶基因bar 的甜菜叶绿体转化载体pSKARBt/bar,以甜菜叶绿体基因组中atpB/rbcL做同源片段,以甜菜叶绿体16S启动子和终止子为调控基因,以bar矿基因为筛选标记基因.基因枪法转化甜菜叶柄,经筛选获得抗性转基因植株.对转基因植株进行外源基因 Bt crylAc和bar的PCR检测、DNA印迹分析,结果表明:外源基因Bt crylAc和bar确已导入到甜菜叶绿体基因组中.转基因植株除草剂抗性鉴定及其离体叶片虫试鉴定结果表明:转基因植株具有较强的杀虫活性和抗除草剂特性,表达了相应的蛋白质.研究结果还表明:bar基因在植物叶绿体转化中,既可以用作抗性基因,又可用作转化体筛选的标记基因.建立了甜菜叶绿体转化体系.     

转单、双Bt基因741杨外源基因表达和抗虫性比较

【目的】研究联合使用两种或两种以上的抗虫基因的抗虫效果, 同时鉴定并筛选出转双Bt基因741杨对鳞翅目和鞘翅目害虫有较强抗性的株系。【方法】选取转三基因（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741杨8个株系、 转双基因（Cry1Ac+API）741杨1个株系和转单基因（Cry3Aa）741杨3个株系为试材, 从外源基因PCR检测、 毒蛋白表达和抗虫性三方面对转基因株系进行对比分析。【结果】经PCR扩增后各转基因株系出现了预期的电泳条带。ELISA蛋白检测显示转基因株系中都有与所含基因相应的Bt杀虫蛋白表达。用转基因株系新鲜叶片进行柳蓝叶甲Plagiodera versicolora和美国白蛾Hyphantria cunea室内饲虫实验表明： 转入不同抗虫基因的杨树对昆虫的抗性具有选择性, 对非靶标昆虫没有毒杀作用。转双Bt基因741杨具有双抗性, 不同转基因株系表现出高中低的抗性水平： 在对柳蓝叶甲的抗性上, 筛选出的其中5个高抗株系（pCCA1, pCCA2, pCCA5, pCCA6和pCCA9）的抗性水平明显比含Cry3Aa单Bt基因的3个高抗株系（pCC11, pCC53和pCC84）高; 在对美国白蛾的抗性上, 有7个株系（pCCA2~pCCA7和pCCA9）的抗性水平与含Cry1Ac单Bt基因株系（pB29）表现一致, 只有1个株系（pCCA1）对美国白蛾表现出了极低的抗性。【结论】多个抗虫基因在741杨上的联合使用, 不仅扩大了抗虫谱, 其中的高抗株系还具有了更高的抗虫能力, 有效地发挥了基因的叠加效应。     

盐城棉区棉铃虫田间种群对Bt蛋白的抗性基因频率

【背景】转Bt基因抗虫棉已经在我国进行了近20年的大规模商业化种植,产生了显著的经济和环境效益。但是,靶标害虫棉铃虫的抗性是转Bt基因抗虫棉产业健康发展所面临的最大问题,而抗性监测是解决这一问题的必要管理措施。盐城市是江苏省转基因抗虫棉的主产区,但有关该地区棉铃虫对转Bt基因抗虫棉的抗性基因频率未见报道。【方法】于2012年在盐城三龙镇和东台镇棉区采集田间棉铃虫种群,检测了初孵幼虫对花铃期转Bt基因抗虫棉中30幼嫩叶片的敏感性,用区分剂量法检测了2龄幼虫对Bt蛋白的抗性基因频率。【结果】取食转Bt基因抗虫棉叶片后,棉铃虫初孵幼虫在9 d内全部死亡;三龙镇和东台镇棉铃虫2龄幼虫对Bt蛋白的抗性基因频率分别为7.6×10-3和6.9×10-3。【结论与意义】目前,盐城棉区的棉铃虫对转Bt基因抗虫棉仍保持很高的敏感性,棉铃虫种群对Bt蛋白的抗性基因频率没有发生显著变化,但仍需持续监测。     

转Bt基因抗虫水稻的研究进展与生态安全评价

表达杀虫蛋白的转Bt基因植物正在改革着现代农业．综述了国内外转Bt基因水稻及其抗虫性的研究进展及水稻害虫对Bt水稻的抗性风险及抗性管理策略,提出了对转基因Bt水稻进行生态安全风险评价的具体内容．     

棉铃虫对Bt杀虫剂的抗性遗传方式

随着转基因棉花种植面积的日益增加,棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner)对Bt的抗性已经成为一个不容忽视的问题。发展转多价基因作物是当前缓解害虫对Bt抗性的最有效措施。本研究以经室内多年筛选的、抗性倍数达2 000多倍的Bt杀虫剂（含多种蛋白）抗性品系为材料,通过生物测定和不同的杂交试验,测定棉铃虫对Bt杀虫剂的抗性遗传方式,以期为Bt生物农药的抗性治理提供一定的依据,同时为制定棉铃虫对转多基因作物的抗性治理策略提供一定的参考。对敏感亲本和抗性亲本杂交产生的F1代的研究结果表明,杂交品系的抗性倍数分别为22.2倍和24.6倍;抗性显性度D值均小于0,分别为-0.20和-0.17,抗性为常染色体不完全隐性遗传。对4种回交后代和2种自交后代F2的研究结果表明,实际死亡率与期望死亡率差异较大,说明抗性是由单基因多个位点或多基因控制。     

棉铃虫对转Bt基因棉花的行为反应

棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是转Bt基因棉花(Bt棉)最重要的靶标害虫之一。害虫对Bt棉的抗性问题是Bt棉产业持续健康发展的最主要威胁。规避行为可以减少害虫与Bt棉的接触而降低生理抗性选择压力。在本研究中,通过比较棉铃虫对Bt棉与常规棉的行为反应评估了棉铃虫对Bt棉的行为规避能力。产卵选择结果显示,棉铃虫成虫在Bt棉上的落卵量显著低于常规棉。幼虫实验结果显示,棉铃虫初孵幼虫在Bt棉植株上的居留时间显著短于在常规棉上的居留时间。无选择条件下,1龄幼虫在对Bt棉叶的取食空洞数以及总取食量均显著低于常规棉叶。综合以上的结果,认为棉铃虫对Bt棉具有一定的行为规避能力,这可能是延缓棉铃虫对Bt棉产生抗性的因素之一。本研究能够帮助有效地预测靶标害虫对Bt作物的抗性风险。     

转Bt基因植物中外源基因时空动态表达的研究现状

在转Bt基因植株中 ,外源基因的时空动态表达对于害虫的防治和转基因安全评价管理具有重要意义。利用生物测定法和酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,对植物不同组织在同一发育阶段、同一组织在不同的发育阶段以及不同转基因植株的外源基因的时空动态表达进行研究。本文综述了转基因植物中外源基因时空动态表达的研究进展和现状。     

棉铃虫对Bt生物农药早期抗性及与转Bt基因棉抗虫性的关系

用饲料感染法建立了棉铃虫Helicoverpa rmigera(Hubmer)敏感品系(SUS1)对Bt生物农药的敏感毒力基线和区分剂量,1995年测定了五省六县棉铃虫初孵幼虫对Bt生物农药的敏感性,结果表明：山东阳谷、河北邯郸、河南新乡、安徽萧县及江苏丰县棉铃虫已产生早期抗性,抗性个体百分率为5%～10%,与敏感品系相比,LC₅₀值稍有增加,但斜率b值明显变小;而江苏东台棉铃虫仍属敏感。这是国内外首次诊测到棉铃虫对Bt生物农药抗性。用棉叶喂饲法测定比较了转Bt基因棉花品系对不同种群棉铃虫的抗虫性效果,结果表明：用早期抗性的阳谷和新乡棉铃虫初孵幼虫接虫5d后平均死亡率较敏感品系下降16%～29%,说明棉铃虫对Bt农药与转Bt生物基因棉花品系间存在交互抗性。还讨论了Bt农药的抗性治理对策。     

棉铃虫对Bt生物农药早期抗性及与转Bt基因棉抗虫性的关系

用饲料感染法建立了棉铃虫Helicoverpa rmigera(Hubmer)敏感品系(SUS1)对Bt生物农药的敏感毒力基线和区分剂量,1995年测定了五省六县棉铃虫初孵幼虫对Bt生物农药的敏感性,结果表明：山东阳谷、河北邯郸、河南新乡、安徽萧县及江苏丰县棉铃虫已产生早期抗性,抗性个体百分率为5%～10%,与敏感品系相比,LC₅₀值稍有增加,但斜率b值明显变小;而江苏东台棉铃虫仍属敏感。这是国内外首次诊测到棉铃虫对Bt生物农药抗性。用棉叶喂饲法测定比较了转Bt基因棉花品系对不同种群棉铃虫的抗虫性效果,结果表明：用早期抗性的阳谷和新乡棉铃虫初孵幼虫接虫5d后平均死亡率较敏感品系下降16%～29%,说明棉铃虫对Bt农药与转Bt生物基因棉花品系间存在交互抗性。还讨论了Bt农药的抗性治理对策。     

甜菜(Beta vulgaris L.)叶绿体转化体系建立及抗虫和抗除草剂植株的获得

为建立外源基因甜菜叶绿体转化体系,利用分子生物学方法构建了包含有编码苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因Bt cry1Ac和编码膦丝菌素乙酰转移酶基因bar的甜菜叶绿体转化载体pSKARBt/bar,以甜菜叶绿体基因组中atpB/rbcL做同源片段,以甜菜叶绿体16S启动子和终止子为调控基因,以bar基因为筛选标记基因．基因枪法转化甜菜叶柄,经筛选获得抗性转基因植株．对转基因植株进行外源基因Bt cry1Ac和bar的PCR检测、DNA印迹分析,结果表明：外源基因Bt cry1Ac和bar确已导入到甜菜叶绿体基因组中．转基因植株除草剂抗性鉴定及其离体叶片虫试鉴定结果表明：转基因植株具有较强的杀虫活性和抗除草剂特性,表达了相应的蛋白质．研究结果还表明：bar基因在植物叶绿体转化中,既可以用作抗性基因,又可用作转化体筛选的标记基因．建立了甜菜叶绿体转化体系．     

利用花粉管通道技术导入大豆抗病虫目的基因

采用花粉管通道技术,将几丁质酶基因导入14个大豆品种,共导入1125朵花,花朵的成活率为47.8%,将Bt基因导入11个大豆品种,共导入260朵花,花朵的成活率为40.8%。8个转Bt基因品种中的D1代共收获192粒种子,获得幼苗132株,出苗率为68.75%,把转Bt基因的132株植株用X-Gluc溶液检测,没有发现阳性反应,将转Bt基因的132株植株进行PCR检测,得到5株阳性转化植株,对D1代获得的5株阳性转化植株的D2代,进行PCR检测,得到D2代稳定遗传的阳性转化植株2株。     

湖北棉区转Bt基因棉对棉铃虫的控制作用

2000-2001年通过田间系统调查,表明转Bt基因棉（品种为GK19）在湖北江汉平原棉区对棉铃虫抗性稳定。试验设3个处理：转Bt基因棉化防田（使用化学农药控制害虫）、转Bt基因棉自控田（依靠天敌控制害虫）及常规棉对照田（利用综合防治措施控制害虫）。从棉铃虫的第2代到第5代整个发生期内,即使在不进行化学防治的情况下,棉铃虫在Bt棉田的发生量也保持在极低的水平(最高百株虫量为12头)。室内饲养结果表明,转Bt基因棉对棉铃虫的生长发育（幼虫体重、蛹重）有较为明显的影响,使6龄幼虫体重减少25.6%,蛹重减少18.2%。棉铃虫幼虫取食转Bt基因棉组织后,发育迟缓,相对于常规棉喂养的整个发育历期延长17 d,使棉铃虫在田间的危害减少至少一个世代。另外,接虫试验表明,棉铃虫幼虫在常规棉上的取食时间是转Bt基因棉株上的6.1倍,极大地减轻了棉铃虫的危害程度。