BT799玉米对亚洲玉米螟抗性研究

【目的】抗螟性鉴定是转基因抗虫玉米研发的重要一环。本文主要就转基因玉米BT799对亚洲玉米螟的抗性展开评价,同时测定了BT799植株组织中Cry1Ac蛋白的表达量。【方法】采用了酶联免疫吸附测定法(ELISA)、室内生测和田间人工接虫鉴定3种方法。【结果】转基因抗虫玉米BT799组织中Cry1Ac蛋白含量分别为768.0 ng/g(蛋白/鲜叶重)和1 452.8~2 978.5 ng/g(蛋白/花丝、苞叶或幼嫩籽粒干重)。田间心叶期接虫条件下转基因抗虫玉米BT799和CC-2XBT799表现高抗亚洲玉米螟。室内取食转Cry1Ac基因玉米不同组织的亚洲玉米螟敏感幼虫7 d后的存活率为0~37.5%,取食非转基因对照的存活率为89.9%~100.0%。亚洲玉米螟不同抗性品系取食郑单958K组织的存活率以Cry1Ie抗性品系最低,其次是Cry1F抗性品系,均显著低于取食对照郑单958,Cry1Ac抗性品系最高,与对照差异不显著。【结论】转Cry1Ac基因玉米BT799对亚洲玉米螟有很高的杀虫作用和良好的田间抗螟性。     

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM030 4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94 μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。     

棉铃虫对不同Bt蛋白的抗性及交互抗性研究

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)对Bt(Bacillus thuringiensis)的抗性问题是阻碍Bt抗虫棉持续发展的关键,探究棉铃虫对不同Bt蛋白的抗性演化趋势及交互抗性,可为选择合适的抗虫棉花备选基因提供参考。【方法】在室内通过连续多代筛选,获得了5个对Bt具有不同抗性的品系,利用饲料混合法测定了这些品系棉铃虫的交互抗性。【结果】经筛选后棉铃虫对Cry1Ac产生了超高水平的抗性、对Cry2Ab、Vip3Aa产生了超低抗性(耐性);Cry1Ac抗性棉铃虫停止筛选而换成Cry2Ab或Vip3Aa继续筛选后,棉铃虫对Cry1Ac抗性水平明显降低,对Cry2Ab或Vip3Aa产生低抗或超低抗性(耐性)。Cry1Ac抗性棉铃虫对Cry1Ab敏感性显著降低,而对Cry2Ab、Cry2Ah及Vip3Aa敏感性变化不显著;Cry2Ab抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性显著降低;Vip3Aa抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性变化不显著。说明Cry1Ac与Cry1Ab间存在明显交互抗性,与Cry2Ah、Vip3Aa没有交互抗性;而Cry2Ab与Cry1Ac间存在不对称的交互抗性。【结论】在筛选新杀虫基因或叠加基因时,应充分考虑抗性发展及交互抗性问题,Cry2Ah、Vip3Aa是治理Cry1Ac抗性棉铃虫或与Cry1Ac叠加最优的选择。     

转Bt基因棉花中Cry1Ac蛋白经烟粉虱途径向龟纹瓢虫的传递

【目的】烟粉虱Bemisia tabaci是转基因棉的非靶标害虫,对棉花生产造成严重影响。本文探讨转Bt基因棉花中Cry1Ac蛋白在棉花-烟粉虱-龟纹瓢食物链中的传递规律,以期为转基因棉的环境安全评价提供科学依据。【方法】在实验室条件下,以常规棉SM3号、33、SY321为对照,分析转Bt基因棉花GK12、XM33B、SGK321叶片、在这些棉花上取食的烟粉虱、以及捕食烟粉虱的瓢虫体内Cry1Ac蛋白含量。同时,将取食转Bt基因棉花上的烟粉虱的瓢虫转接到对应的受体亲本棉花上,分析瓢虫体内Cry1Ac蛋白含量变化规律。【结果】在转Bt基因棉花上取食的烟粉虱成虫和若虫以及它们的蜜露中均能检测到Cry1Ac蛋白,以转Bt基因棉花上的烟粉虱若虫为食料的龟纹瓢虫体Propylaea japonica内也能检测到Cry1Ac蛋白。龟纹瓢虫取食转Bt基因棉花上的烟粉虱若虫1 d后体内即能检测到Cry1Ac蛋白,并且随着取食时间的延长,体内Cry1Ac蛋白的含量逐渐增加,但到第6~8天后Cry1Ac蛋白的含量相对稳定。取食3个不同品种棉花上烟粉虱若虫的龟纹瓢虫体内Cry1Ac蛋白的含量存在明显差异,这种差异与棉花叶片上表达的Cry1Ac蛋白量呈正相关。但取食后6 d,在3个品种棉花上取食的龟纹瓢虫体内的Cry1Ac蛋白含量之间没有明显的差异。以转Bt基因棉花上的烟粉虱若虫为食料的龟纹瓢虫转移到对应的常规棉亲本上以后,体内的Cry1Ac蛋白的含量迅速下降,但10 d后仍能检测到微量的Cry1Ac蛋白。【结论】转Bt基因棉花中的Cry1Ac蛋白可以通过烟粉虱途径传递到龟纹瓢虫体内,龟纹瓢虫对食料中的Cry1Ac蛋白具有富集作用,并且Cry1Ac蛋白的富集存在饱和现象,富集饱和量与食料中的Cry1Ac含量无关;龟纹瓢虫脱离含有Cry1Ac蛋白的食料环境后,体内的Cry1Ac蛋白可以消减,但在10 d时间内龟纹瓢虫体内仍会有Cry1Ac残留。     

转Bt基因水稻对白符跳虫取食选择行为的影响

【目的】为探讨转基因Bt水稻种植对土壤动物的潜在生态风险性。【方法】本研究将3种转Bt基因水稻及其非转基因亲本水稻叶片残体饲养白符跳虫Folsomia candida,通过观察其粪便的数量与分布以分析白符跳虫对Bt水稻的取食选择行为。【结果】研究结果表明,Bt蛋白(Cry1Ab和Cry1Ac)不会影响白符跳虫的取食选择;而Bt基因插入后导致的水稻成分的变化可能影响了白符跳虫对水稻残体的偏好性。结果可为评估转Bt水稻对土壤生态系统影响提供参考价值,为转Bt水稻安全性评价提供科学的依据。     

东南沿海地区小菜蛾对Bt δ-内毒素和Bt制剂的抗性检测

采用浸叶法测定了2003年秋季、2004年春季采自广东惠州、福建福州、浙江杭州和江苏南京的小菜蛾Plutella xylostella田间种群对Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa以及Bt制剂kurstaki亚种 (Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Btk）的抗性水平。与敏感品系PHI-S相比,广东惠州田间小菜蛾种群的抗性水平最高,其对Cry1Ab和Cry1Ac的抗性分别达到了168和120倍,均为高抗水平; 对Btk制剂的抗性有47倍,达到了中抗水平;对Cry1Aa和Cry2Aa具有低水平抗性 (分别为5.8和5.6倍)。福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小菜蛾种群抗性水平相近,对Cry1Ab和Cry1Ac具有低至中等水平抗性 (8～28倍),对Btk制剂具有低水平抗性 (3.5～7倍),对Cry1Aa和Cry2Aa还没有产生明显抗性。因此,在我国东南沿海地区要注意Btk制剂与Bt其他亚种制剂或其他生物杀虫剂轮换使用,以减小Bt制剂对小菜蛾的选择压力,延缓小菜蛾对Bt抗性的发展。     

转基因抗虫作物鉴定质粒标准分子的构建与应用

苏云金芽胞杆菌基因是转基因抗虫作物中通用的外源功能基因,在绝大多数抗虫转基因作物中均有存在,然而Bt基因检测标准样品的缺乏却限制了我国转Bt基因抗虫作物检测工作的发展。为了弥补传统基体标准样品的缺失,首先将Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A 3种常用Bt外源基因克隆到pUC57质粒上,通过测序、酶切和qPCR等技术对质粒的序列和扩增功能进行了验证,然后对扩增效率和实际应用情况加以测试,评价其转基因检测的适用性,构建了质粒标准分子。结果显示,制备的质粒标准分子测序结果与靶标序列完全符合,酶切结果、qPCR扩增结果和扩增效率等均符合预期,在Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因特异性检测中的应用符合阳性对照要求,表明制备的阳性质粒标准分子能够作为转Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因qPCR基因特异性检测的阳性标准样品。     

Cry1Ie毒素胁迫下亚洲玉米螟的抗性发展及汰选种群对其他Bt毒素的交互抗性

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée) 是危害玉米的重要害虫之一, 转Bt基因抗虫玉米为其防治提供了新的途径。然而, 靶标害虫产生抗性将严重阻碍Bt制剂及转Bt基因抗虫玉米的持续应用。明确害虫对转Bt基因玉米表达的毒素蛋白的抗性演化, 对于制定科学有效的抗性治理策略具有重要的理论和实际意义。本实验通过人工饲料汰选法研究了Bt Cry1Ie毒素胁迫下亚洲玉米螟的抗性发展及汰选14代的种群对其他Bt毒素（Cry1Ab, Cry1Ac和Cry1Fa）的交互抗性, 并观察了Cry1Ie蛋白胁迫对亚洲玉米螟生物学的影响。结果表明： 随着汰选压不断提高, 亚洲玉米螟种群对Cry1Ie毒素的敏感性逐渐下降。汰选14代后, 种群对Cry1Ie毒素的抗性水平提高了23倍。然而, Cry1Ab, Cry1Ac和Cry1Fa对所获Cry1Ie汰选种群的毒力与对敏感种群的毒力相比没有显著差异, 说明Cry1Ie汰选没有引起亚洲玉米螟对Cry1Ab, Cry1Ac和Cry1Fa毒素产生交互抗性。同时, 与敏感种群相比, Cry1Ie汰选14代的种群幼虫平均发育历期延长5.7 d, 蛹重减轻13.7%, 单雌产卵量下降40.0%。本研究结果说明, 大面积单一种植转cry1Ie基因抗虫玉米, 可能引起亚洲玉米螟产生抗性; 亚洲玉米螟Cry1Ie抗性种群对Cry1Ab, Cry1Ac和Cry1Fa没有交互抗性, 含有cry1Ie和cry1Ab, cry1Ac或cry1F双/多基因抗虫玉米, 可作为靶标害虫抗性治理的重要策略。     

不同Bt蛋白对棉铃虫存活率和生长发育的影响

【背景】在我国Bt棉主要以Cry1Ab或Cry1Ac为主,其他新型Bt基因未被转入棉花中用来控制害虫,然而大面积种植单价Bt基因的棉花,将可能会大大增加靶标害虫对该类型Bt棉花抗性频率,因此研究其他新型Bt蛋白对靶标害虫的控制作用显得十分必要。【方法】采用蛋白混入人工饲料的生物测定方法,在室内测定了6种Bt蛋白对棉铃虫初孵幼虫的毒力,比较了浓度为1.0μg·g-1时不同Bt蛋白对棉铃虫幼虫生长发育的影响。【结果】毒力测定结果表明,不同Bt蛋白对棉铃虫初孵幼虫的毒力不同,LC50值由低到高依次为Cry1Ab 0.065μg·g-1、Cry1Ac 0.074μg·g-1、Cry2Ab 0.133μg·g-1、Cry2Aa 11.670μg·g-1、Cry1Ah 13.010μg·g-1和Cry1Ca20μg·g-1。生长发育测定结果表明,Cry1Ab和Cry1Ac对棉铃虫幼虫的生长发育影响最大,Cry2Ab次之;Cry1Ah和Cry2Aa对1龄幼虫的校正死亡率和体重抑制率差别不大,但对2龄幼虫的差异较大,Cry1Ah处理2龄幼虫后体重和生长发育参数与Cry2Ab接近,而Cry1Ca对棉铃虫幼虫生长发育几乎没影响。【结论与意义】Cry1Ah、Cry2Aa和Cry2Ab的毒力不如Cry1Ac和Cry1Ab,但仍可以作为控制棉铃虫幼虫的替代策略。     

棉铃虫中肠钙粘蛋白、氨肽酶N及碱性磷酸酯酶的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响

【目的】Cry1A和Cry2A类Bt蛋白通过特异性地与昆虫中肠上的受体蛋白结合而发挥杀虫作用,现已广泛应用于转基因抗虫作物。本研究旨在进一步明确Cry2A类蛋白的作用机制和Cry1A受体蛋白在Cry2A发挥毒力中的作用。【方法】本研究首先提取了棉铃虫Helicoverpa armigera的BBMV,制备了钙粘蛋白(CAD)、氨肽酶N(APN)和碱性磷酸酯酶(ALP)3种受体蛋白的抗体和抗血清;然后,利用Western blot检测BBMV上这3种受体蛋白后,利用抗体封闭技术比较了敏感棉铃虫和Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中3种受体蛋白的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响。【结果】对敏感品系棉铃虫,这3种已知的Cry1Ac受体蛋白抗血清显著地降低了Cry1Ac和Cry2Aa的毒力。其中APN抗血清对Cry1Ac毒力的影响最大,棉铃虫幼虫的死亡率降低了84.44%;ALP抗血清对Cry2Aa的毒力影响最大,棉铃虫幼虫死亡率比对照降低了71.04%。Cry1Ac对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力显著降低,Cry2Aa的毒性也减弱。在Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中,3种受体抗血清对Cry1Ac的影响比在敏感棉铃虫中的影响小,尤其是CAD和APN抗血清对Cry1Ac毒力的抑制率显著低于在敏感棉铃虫中的抑制作用;CAD和ALP抗血清对Cry2Aa毒力的影响与在敏感棉铃虫中的影响差异不显著,但APN抗血清可以显著降低Cry2Aa对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力。【结论】棉铃虫CAD,APN和ALP不仅参与了Cry1Ac的杀虫过程,也对Cry2Aa毒力有一定的影响,而且这3种蛋白可能与棉铃虫对Cry1Ac和Cry2Aa产生抗性及交互抗性相关。     

Bt毒素诱导下小菜蛾实时定量PCR 内参基因的筛选

【目的】筛选出Bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella (L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA (18S rRNA)、 肌动蛋白（ACTB）、 延伸因子（EF1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、 核糖体蛋白L32 (RPL32)、 核糖体蛋白S13 （RPS13）、 核糖体蛋白S20 （RPS20）和β-微管蛋白(TUB)基因作为候选内参基因, 以geNorm、 Normfinder和BestKeeper软件分析这8个基因在Bt毒素诱导后的小菜蛾不同品系中肠组织中的表达稳定性。并应用筛选出来的内参基因分析小菜蛾氨肽酶2（aminopeptidase N2, APN2）基因的表达水平。【结果】geNorm软件以RPS13和EF1为最稳定内参基因, NormFinder和BestKeeper软件均以RPS13和RPL32为最稳定基因。使用3种不同内参基因分析Bt毒素诱导后的小菜蛾Bt抗性和敏感品系中ANP2表达水平时, 新的内参基因EF1和传统内参基因RPL32表现了良好的稳定性, 二者作为标准化因子, ANP2表达量结果基本一致, 而使用18S rRNA作为内参基因, 却导致部分表达量分析结果有所误差。【结论】筛选出PRS13,RPL32和EF1可以作为小菜蛾某些试验条件下的内参基因, 对小菜蛾基因表达研究奠定了一定基础, 也对其他昆虫内参基因的筛选具有参考价值。     

Bacillus thuringiensis protein transfer between rootstock and scion of grafted poplar

Bacillus thuringiensis (Bt) Cry1Ac protein is a toxin against different leaf‐eating lepidopteran insects that attack poplar trees. In the present study, the mode of migration of the Bt‐Cry1Ac protein within poplar grafts was investigated. Grafting was done using Pb29 (transgenic poplar 741 with cry1Ac genes), CC71 (transgenic poplar 741 with cry3A genes), non‐transgenic poplar 741 and non‐transgenic Populus tomentosa, either as scion or as rootstock. In order to detect migration of Bt‐Cry1Ac protein from one portion of the graft union to different tissues in the grafted plant, ELISA analysis was employed to assess the content of Bt‐Cry1Ac protein in the phloem, xylem, pith and leaves of the grafted poplar. To further verify migration of Bt‐Cry1Ac protein, Clostera anachoreta larvae, which are susceptible to Bt‐Cry1Ac protein, were fed leaves from the control graft (i.e., graft portion that originally did not contain Bt‐Cry1Ac protein). The results showed that Bt‐Cry1Ac protein was transported between rootstock and scion mainly through the phloem. Migration of Bt‐Cry1Ac protein in the grafted union was also evidenced in that the leaves of the control graft did have a lethal effect on C. anachoreta larvae in laboratory feeding experiments.     

Genetics of resistance to transgenic Bacillus thuringiensis poplars in Chrysomela tremulae (Coleoptera: Chrysomelidae)

The area under genetically engineered plants producing Bacillus thuringiensis (Bt) toxins is steadily increasing. This increase has magnified the risk of alleles conferring resistance to these toxins being selected in natural populations of target insect pests. The speed at which this selection is likely to occur depends on the genetic characteristics of Bt resistance. We selected a strain of the beetle Chrysomela tremulae Fabricius on a transgenic Bt poplar clone Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx producing high levels of B. thuringiensis Cry3Aa toxin. This strain was derived from an isofemale line that generated some F2 offspring that actively fed on this Bt poplar clone. The resistance ratio of the strain was >6400. Susceptibility had decreased to such an extent that the mortality of beetles of the strain fed Bt poplar leaves was similar to that of beetles fed nontransgenic poplar leaves. Genetic crosses between susceptible, resistant, and F1 hybrids showed that resistance to the Cry3Aa toxin was almost completely recessive (D(LC) = 0.07) and conferred by a single autosomal gene. The concentration of Cry3Aa produced in the transgenic Bt poplar used in this study was 6.34 times higher than the LC99 of the F1 hybrids, accounting for the complete recessivity (D(ML) = 0) of survival on Bt poplar leaves. Overall, the genetic characteristics of the resistance of C. tremulae to the Cry3Aa toxin are consistent with the assumptions underlying the high-dose refuge strategy, which aims to decrease the selection of Bt resistance alleles in natural target pest populations.     

Bt-Cry5Aa 基因转化棉花及其抗虫性鉴定

我国棉花抗虫基因大都为Cry1Ab/c,抗性风险日趋增加。本研究依据棉花密码子偏好,人工合成Bt-Cry5Aa抗虫基因,通过花粉管通道法转入棉花,并通过卡那霉素法及PCR方法对不同世代转化株进行鉴定,同时进行了抗虫性测试。结果表明,通过花粉管通道法成功获得转Bt-Cry5Aa基因植株,通过田间卡那霉素鉴定,阳性株率T1为7.76%,T2为73.1%,T3为95.5%;PCR检测显示,T1阳性率为2.35%,T2为55.8%,T3为94.5%;田间抗性试验分析,转Bt-Cry5Aa株系对第2、3、4代棉铃虫校正死亡率分别达到85.42%、75.35%和62.79%,其抗虫性与GK19相比差异不显著;Bt-Cry5Aa能够部分替代目前主流鳞翅目抗虫基因,是棉铃虫的新抗源。     

转基因抗虫棉Bt基因不同剂量的聚合与抗虫性表现

通过有性杂交手段培育出聚有不同数目Bt基因的植株,在不同生育期进行抗虫性测定和Bt毒蛋白表达的ELISA检测,旨在揭示聚合不同数目Bt基因的植株抗虫性的互作表达机理。聚合有1－4个Bt基因的植株在整个生育期的抗虫性、毒蛋白表达特性和单价抗虫棉时空表达一致,生育前期抗虫性好、毒蛋白表达量高;生育中、后期抗虫性有所下降,毒蛋白表达量降低。聚合有4个Bt基因的纯合材料并未因Bt基因的增加而起到抗性增强的效果,相反还因同源抑制而有所降低。不同来源的Bt基因处于杂合状态时其抗虫性和Bt毒蛋白量均得到充分表达。     

环氧苍耳素Ⅰ对菜青虫中肠消化酶和羧酸酯酶活性的影响

【目的】探明苍耳Xanthium sibiricum活性物质--环氧苍耳素Ⅰ对菜青虫的作用机理。【方法】采用饲喂法处理4龄菜青虫Pieris rapae, 测试从苍耳中分离提纯的环氧苍耳素Ⅰ（为倍半萜内酯类物质）对菜青虫中肠蛋白酶、 淀粉酶和羧酸酯酶活性的影响。【结果】环氧苍耳素Ⅰ对蛋白酶活性的抑制最强, 处理后12, 24和48 h, 菜青虫中肠蛋白酶抑制率分别为20.95%,29.38%和50.06%; 其次为淀粉酶, 抑制率分别为11.89%,39.01%和31.92%。同时,中肠羧酸酯酶活性在处理后12 h与对照之间无显著变化, 24 h 时活性被显著抑制, 而48 h时活性却明显高于对照。【结论】环氧苍耳素Ⅰ对昆虫中肠消化酶活性的抑制, 可能是引起昆虫表现取食抑制和生长发育不良的重要原因之一。     

桔小实蝇细胞凋亡基因hid的克隆及不同发育阶段表达分析

【目的】细胞凋亡是一个细胞自动结束生命的过程,也称为程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）。头部退化缺陷基因 (head involution defective, hid )是昆虫细胞凋亡基因RHG家族的成员,该家族基因通过克服凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins, IAPs）的保护作用来保证PCD的发生。本研究旨在克隆和分析桔小实蝇Bactrocera dorsalis的hid基因,并研究其在各发育阶段的表达情况。【方法】利用RT-PCR和RACE技术获得了桔小实蝇hid基因的cDNA全长序列。利用荧光定量PCR对hid基因在桔小实蝇不同发育阶段的转录水平进行分析。【结果】克隆获得桔小实蝇hid cDNA序列,将其命名为Bdhid (GenBank登录号为KJ461670),其开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸。氨基酸序列分析显示其具有一个短的N-端肽基元( IAP-binding-motif, IBM) 和C-端Grim Helix 3 (GH3) 结构域,与其他已知的双翅目昆虫hid基因有较高的同源性。实时荧光定量PCR检测结果表明,该基因在桔小实蝇的幼虫期表达水平较低,蛹期及成虫期表达量显著升高。【结论】这些结果为进一步研究hid基因在桔小实蝇细胞凋亡途径中的功能及其转基因条件致死品系的获得奠定了基础。     

小菜蛾U6 snRNA基因的克隆及作为miRNA定量表达分析内参基因的评价

【目的】克隆小菜蛾Plutella xylostella (L.)小分子非编码RNA U6的cDNA序列,并评价其是否适合作为定量检测小菜蛾microRNA (miRNA)表达量的内参基因。【方法】本研究采用RT-PCR 克隆获得了小菜蛾4龄幼虫核小RNA(small nuclear RNA, snRNA) U6的cDNA序列,并用定量PCR法检测了U6及8种miRNAs在小菜蛾不同发育阶段及不同杀虫药剂处理后的表达稳定性。【结果】小菜蛾U6的cDNA序列全长 94 bp,与其他昆虫U6的核苷酸序列一致性达98.9%。用geNorm和RefFinder软件分析荧光定量PCR结果表明,U6在小菜蛾卵、1-4龄幼虫、蛹和成虫7个不同发育阶段表达稳定;用马拉硫磷、毒死蜱、辛硫磷、灭多威、呋喃虫酰肼、高效氯氰菊酯、氯虫苯甲酰胺、溴虫腈和Bt 9种不同作用机理的杀虫药剂处理3龄末幼虫48 h,对U6的表达水平无显著影响。【结论】小菜蛾U6表达水平不受不同发育阶段和不同杀虫药剂处理的影响,符合作为内参基因的基本特点,可作为定量PCR法评价小菜蛾miRNA或其他非编码小分子RNA表达水平的内参基因。研究结果为小菜蛾miRNA表达水平的准确定量奠定了基础。     

棉铃虫普通气味受体基因HarmOR9和HarmOR29的克隆和组织表达分析

【目的】对棉铃虫Helicoverpa armigera 2个普通气味受体基因的cDNA全长进行分析,明确这两个普通气味受体基因在不同组织中的表达分布,为进一步的功能研究奠定基础。【方法】利用PCR结合RACE技术克隆棉铃虫两条普通气味受体基因的cDNA全长;利用不同的生物信息学软件对序列进行结构预测、序列比对和进化树分析;利用半定量RT-PCR检测其在棉铃虫成虫不同组织中的表达。【结果】获得两条棉铃虫气味受体基因的全长序列,并命名为HarmOR9和HarmOR29（GenBank登录号分别为KJ188252和KJ188253）。序列分析显示,HarmOR9全长1 206 bp,编码401个氨基酸;HarmOR29全长1 188 bp,编码395个氨基酸。选择已报道的鳞翅目昆虫烟青虫Heliothis assulta、家蚕Bombyx mori、烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫的气味受体与本实验克隆得到的两个气味受体基因的编码产物进行序列比对和进化树分析,结果显示这两个气味受体与性信息素受体区别明显,并与其他普通气味受体聚类在一起。半定量RT-PCR的结果显示HarmOR9与HarmOR29都主要在触角中高表达且无雌雄间差异,HarmOR29在其他组织中均不表达;而HarmOR9在雄虫下唇须中有微量表达,在其他组织中均不表达。【结论】本研究从棉铃虫中克隆得到2个气味受体基因HarmOR9和HarmOR29的cDNA全长,其编码产物具有气味受体的典型特征并且属于普通气味受体。明确了这两个气味受体基因都在棉铃虫成虫的触角中高表达,且无雌雄差异,推测其可能参与了棉铃虫普通气味的识别过程。     

我国三地区黑腹果蝇中Wolbachia的系统发育关系及其对宿主生殖的影响

【目的】Wolbachia 是广泛存在于节肢动物和丝状线虫体内的一类共生菌, 能够以多种方式对宿主产生影响。精卵细胞质不亲和（CI）是其引起的最普遍的表型, 即感染Wolbachia的雄性宿主与未感染或感染不同品系的雌性宿主交配后, 不能产生后代或后代极少, 而感染同品系Wolbachia的雌雄宿主交配后则能正常产生后代。我们前期研究发现, 湖北武汉、 云南六库和天津3个地区黑腹果蝇Drosophila melanogaster被Wolbachia感染。本研究旨在明确这3个地区黑腹果蝇中Wolbachia的系统发育关系及其对宿主生殖的影响。【方法】利用Clustal X软件对Wolbachia的wsp基因序列进行比对, 利用MEGA软件构建系统发育树。采用多位点序列分型（MLST）的方法对Wolbachia进行分型。通过区内交配和区之间杂交的方式研究不同地区黑腹果蝇体内Wolbachia 的关系及其对果蝇生殖的影响。【结果】湖北武汉、 云南六库和天津3个地区黑腹果蝇中感染的Wolbachia都是属于A大组的Mel亚群。这3个地区果蝇感染的Wolbachia的序列类型（ST）不同, Wolbachia之间存在一定的差异。湖北武汉和天津果蝇中的Wolbachia能引起强烈的CI表型, 而云南六库果蝇中的Wolbachia引起的CI强度相对较弱。武汉果蝇中Wolbachia不能完全挽救天津果蝇中Wolbachia引起的CI表型, 而天津果蝇中Wolbachia也不能完全挽救武汉果蝇中Wolbachia引起的CI表型。【结论】武汉和天津地区黑腹果蝇中的Wolbachia可能距离较远。Wolbachia的长期共生可能对黑腹果蝇的进化产生了一定的影响, 湖北武汉与云南六库的黑腹果蝇中感染的Wolbachia属于不同的序列类型, 这2个地区的黑腹果蝇已发生了一定的分歧, 产生了一定的生殖隔离。