猪瘟兔化弱毒E2蛋白A／D区的高效表达和蛋白纯化及其应用

本试验对表达猪瘟E2囊膜糖蛋白的原核表达载体pET—E2的表达条件进行了优化,在此基础上,对表达的蛋白质进行了纯化。在6mol/L盐酸胍存在的条件下,将包涵体溶解在Tris-HCl中,并直接用于His Band亲和层析。收集过柱产物并透析,在2％SDS条件下,对所得的重组蛋白质进行了定量。重组蛋白质被用来包被96孔ELISA板并应用于免疫猪瘟抗体水平的测定。     

PSCA-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

旨在大肠杆菌中表达PSCA-HSPT0融合蛋白,并对其进行纯化.克隆人PSCA基因及HSP70基因,构建表达PSCA-HSP融合蛋白的工程菌,优化表达及纯化条件,对重组蛋白进行纯化.结果表明,成功构建重组表达质粒PSCA-HSP,重组蛋白得到可溶性表达,优化纯化条件后获得90%以上纯度的重组蛋白.本研究成功实现了PSCA与HSP的融合表达,为下一步肿瘤疫苗的研制奠定基础.     

麻疯树核糖体失活蛋白Curcin2的原核可溶性表达及其抗真菌活性研究

Curcin2是麻疯树幼苗在真菌侵染、干旱及高低温胁迫下诱导产生的一种核糖体失活蛋白.采用分子克隆的方法,从麻疯树基因组中扩增到Curcin2成熟肽编码基因,分别连接到质粒载体pGEX-6p-1、pMAL-c5E上,转化大肠杆菌最终获得重组菌PGC(pGEX-6p-1-curcin2)和PMC(pMAL-c5E-curcin2).在不同温度、IPTG浓度、时间诱导下,Curcin2在重组菌PGC中均以包涵体形式表达,在重组菌PMC中主要以可溶性融合蛋白形式表达,且蛋白质的表达量与诱导条件相关.重组菌PMC表达可溶性curcin2的优化条件为:温度28℃,IPTG 0.3mmol/L,时间8h,此条件下目的蛋白占总蛋白表达量的30.6％,1L培养物中可获得19.74mg电泳纯的重组蛋白.重组蛋白可被MBP TrapTM HP柱亲和纯化并与curcin抗体发生抗原抗体反应.体外抗真菌活性实验表明,纯化后的curcin2融合蛋白有抑制真菌生长作用,且对小麦赤霉、油菜菌核的抑制作用强于curcin.此蛋白的获得为其相关功能的研究奠定了基础.     

重组蛋白包涵体的复性研究

重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往形成不可溶、无生物活性的包涵体,需经过变性溶解后,在适当条件下复性形成天然的构象,才可恢复其生物活性．变复性实验是建立在对蛋白质体外折叠机制的了解的基础上．根据近年来对蛋白质折叠机制的认识和重组蛋白包涵体在复性方面的主要进展,论述以下3个方面的内容：1)蛋白质在细胞内的折叠机制;2)蛋白质体外折叠机制;3)蛋白质复性的策略和方法．     

FABP5基因重组突变体蛋白抗前列腺癌细胞活性分析

为构建脂肪酸结合蛋白5 (FABP5)突变体的原核表达体系,评价突变体蛋白质体外抗前列腺癌细胞的活性.利用定点突变技术,突变FABP5蛋白脂肪酸结合的3个关键位点,并构建原核表达体系,对重组蛋白质进行原核表达、分离纯化.通过细胞毒性、细胞划痕和细胞侵袭试验,评价重组FABP5突变体蛋白质对前列腺癌细胞22RV1和PC3增殖、迁移和侵袭的影响.结果 显示定点突变后的DNA与表达载体pQE32连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),经序列测定正确,构建了重组表达工程菌,并诱导表达的重组蛋白经亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白;三突变体对细胞的增殖、迁移和侵袭抑制作用比3个单突变体和3个双突变体抑制效果明显;单突变体和双突变体组内对细胞的增殖、迁移和侵袭抑制作用差异较小;而野生型重组蛋白质对两株细胞的增殖、迁移和侵袭具有促进作用.本研究从所有突变体中筛选出FABP5的三突变体重组蛋白质对前列腺癌细胞抑制作用较好,为后续开发去势抵抗性前列腺癌(CRPC)蛋白质药物提供参考.     

艰难梭菌毒素A原核表达及重组蛋白纯化

目的构建艰难梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)毒素A羧基末端原核表达载体,优化诱导表达条件及纯化重组蛋白。方法利用聚合酶链式反应扩增C.difficile毒素A羧基末端基因序列,并将此序列转入pET-28b载体,构建pET-28b-tcdA重组表达载体,并将表达载体转化到BL21(DE3)感受态大肠埃希菌细胞中,分别在不同条件下进行诱导表达,获得最佳诱导表达条件后进行大量表达,最后用Ni柱对重组蛋白进行亲和纯化,得到纯化后的重组蛋白。结果成功构建了pET-28b-tcdA重组表达载体,其重组蛋白表达最佳诱导条件:菌液吸光度值取0.6、温度取25℃、IPTG终浓度取1.0mmol/L、诱导时间取10h。蛋白纯化咪唑磷酸盐洗脱液最佳浓度取200mmol/L。结论成功构建pET-28b-tcdA重组表达载体,在大肠埃希菌BL21(DE3)中可以有效表达,并获得高浓度重组蛋白,为进一步制备TcdA适配子奠定了一定实验室基础。     

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变, 然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET-28a(+)中,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL21(DE3)plysS中,在IPTG的诱导下, 重组转化菌可高效表达目的基因, 表达量平均可达菌体蛋白总量的28%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。此重组蛋白免疫的家兔可抵抗猪瘟兔化弱毒的攻击。     

人GLP -1- IgG Fc融合蛋白在毕赤酵母中的高效表达

目的:构建GLP-1-IgG Fc融合蛋白分子并在毕赤酵母中实现高效表达.方法:使用蛋白质工程技术改造GLP -1,去除其蛋白酶降解位点,然后利用重叠延伸PCR方法得到改造后的GLP -1与人IgG-Fc片断的嵌合体基因并将其插入pPIC9K载体中.以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行表达.采用SDS-PAGE和Western Blot方法检测重组蛋白的表达.结果:成功的构建了GLP -1-IgG Fc嵌合体基因并使其在重组毕赤酵母中高效分泌表达.在25℃条件下,摇瓶培养添加0.5％甲醇诱导72h后融合蛋白的表达量最大,为5mg/L.SDS-PAGE和Westem-Blot结果表明表达产物为GLP -1-IgG Fc融合蛋白.结论:获得了高效表达GLP -1-IgG Fc融合蛋白的毕赤酵母菌株,为GLP -1-IgG Fc的活性和半衰期测定及下一步的开发奠定了基础,并为在毕赤酵母菌中表达其他Fc融合蛋白和抗体提供了参考.     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒的构建及其在兔体内的免疫原性分析

为了构建猪瘟重组腺病毒载体疫苗,通过细菌内同源重组法构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2.测定其一步生长曲线,同时用间接免疫荧光试验和Western blotting检测外源基因表达,然后用rAdV-E2免疫家兔,免疫后6周用猪瘟兔化弱毒疫苗株(c株)进行攻击,攻毒后3 d取其脾脏,用实时荧光定量RT-PCR检测C株病毒RNA.结果表明,该重组腺病毒传至第10代时,毒价可达1.0×1010TCID<,50/mL;外源基因可在其中得到稳定表达;rAdV-E2接种兔免疫后2周产生猪瘟特异性抗体,免疫后5 W抗体达到峰值,攻毒后rAdV-E2接种兔和C株接种兔均未出现定型热反应,从其脾脏也未检测到C株病毒RNA,而野生型腺病毒接种兔均出现了定型热反应,并且从其脾脏检测大量C株病毒RNA,其含量达到了103拷贝/μL以上.由此表明,rAdV-E2可望开发为猪瘟候选疫苗.     

Embryo and Endosperm Function and Failure inSolanumSpecies and Hybrids

Although the importance of the endosperm as a food store inmany angiosperm seeds is well known, its significance duringearly embryogenesis has been neglected. In many interspecifichybrids, and in some other situations, embryos do not developfully and abort. It has often been stated that this is causedby the endosperm failing to conduct sufficient nutrients tothe embryo, but seldom has it been suggested that the endospermactively controls most of the early stages of morphogenesisof the embryo. Information gleaned from a broad survey of theliterature, combined with additional evidence presented here,obtained fromSolanum incanumand interspecific hybrids, indicatethat the endosperm is dynamic and very active in regulatingearly embryo development. This requires highly integrated geneticcontrol of rapidly changing metabolism in the endosperm. Ininterspecific hybrids, lack of coordination may cause unbalancedproduction of growth regulating substances by the endospermand hence abortion of the embryo, or even unregulated productionof nucleases and proteases resulting firstly in autolysis ofthe endosperm and then digestion of the embryo. The endospermmay thus serve to detect inappropriate hybridization of speciesor ploidy levels and so prevent waste of resources by producingseeds that would result in sterile hybrids or unthrifty subsequentgenerations. This discriminatory function of the endosperm hasdiminished during evolution and domestication of the crop plantSolanummelongenaL.Copyright 1998 Annals of Botany Company Solanum, embryo morphogenesis, endosperm, hybrid, seed development.     

环腺苷酸应答元件结合蛋白与学习记忆

环腺苷酸(cAMP)应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)是一种核转录因子,可与cAMP反应元件结合,调节基因转录,具有调节精子生成,昼夜节律,学习记忆等功能.近年来关于其在学习记忆中的作用成为医学研究热点.CREB是神经元内多条信息传递途径的汇聚点,参与长时记忆形成和突触可塑性.长时记忆(long-term memory)形成需依赖CREB介导的基因转录,干扰或抑制CREB活性可破坏长时记忆.长时程增强(long-term potentiation,LTP)是研究学习记忆的理想模型,在LTP诱导和维持过程中均可观察到CREB活性持续升高.但增龄过程中,海马CREB活性下降,影响学习记忆功能,与许多神经退行性疾病发生有关.     

HIFs and tumors--causes and consequences

For most organisms oxygen is essential fo life. When oxygen levels drop below those required to maintain the minimum physiological oxygen requirement of an organism or tissue it is termed hypoxia. To counter act possible deleterious effects of such a state, an immediate molecular response is initiated causing adaptation responses aimed at cell survival. This response is mediated by the hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), which is a heterodimer consisting of an alpha- and a beta-subunit. HIF-1 alpha protein is stabilized under hypoxic conditions and therefore confers selectivity to this response. Hypoxia is characteristic of tumors, mainly because of impaired blood supply resulting from abnormal growth. Over the past few years enormous progress has been made in the attempt to understand how the activation of the physiological response to hypoxia influences neoplastic growth. In this review some aspects of HIF-1 pathway activation in tumors and the consequences for pathophysiology and treatment of neoplasia are discussed.