饲喂Bt水稻的褐家鼠肠道中cry1Ab/Ac基因和蛋白的残留检测北大核心CSCD

分别用含有转cry1Ab/Ac基因水稻和亲本水稻的饲料饲喂野生褐家鼠,旨在检测外源cry1Ab/Ac基因和蛋白在褐家鼠雌鼠雄鼠空肠、回肠、盲肠中的残留情况。检测结果显示,饲喂转基因水稻50 d和110 d的雌雄褐家鼠肠道3个部位中没有检测到cry1Ab/Ac基因残留,在体外消化实验中过量外源基因全长及片段在4 h后开始逐步降解,约12 h全部降解。3个肠道部位提取的蛋白进行ELISA和Western blot分析,结果显示肠道内容物中无Cry1Ab/Ac蛋白残留。因此外源基因和蛋白不会在饲喂了转基因水稻的野生褐家鼠肠道中残留。     

转基因水稻cry1Ab/Ac基因及蛋白在肉鸡肠道中的残留检测

旨在研究转基因水稻对饲喂肉鸡的影响,以含有转cry1Ab/Ac基因水稻的饲料饲喂肉鸡,分析了肉鸡空肠、回肠、盲肠、直肠中cry1Ab/Ac基因和蛋白残留情况,并用体外实验验证了外源基因的降解情况。结果表明,饲喂转cry1Ab/Ac基因水稻21 d和42 d的肉鸡肠道4个部位中没有检测到cry1Ab/Ac基因残留,体外消化外源基因的实验发现外源基因在肉鸡肠道中约4 h后开始逐步降解。对上述4个部位内容物进行ELISA和Western blot分析,均未检测到Cry1Ab/Ac蛋白残留。综合分析表明,转基因水稻中的外源基因和蛋白在肉鸡肠道中易被消化和降解。     

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM030 4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94 μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。     

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻对大螟幼虫的取食、生长及存活的影响

本文采用活体生测的方法测定了转cry1Ab/cry1Ac基因水稻对大螟Sesamia inferens(Walker)幼虫的取食、生长以及存活的影响。结果表明,以转cry1Ab/cry1Ac基因水稻为食的大螟3龄和5龄幼虫的累计取食量和相对摄食率与对照相比都显著的减少。取食转Bt水稻后,大螟3龄和5龄幼虫体重均出现负增长。随着取食转基因水稻时间的延长,大螟3龄幼虫的校正死亡率可以达到100%,5龄幼虫的校正死亡率达到85%。     

Bt水稻Cry1Ab杀虫蛋白表达的时间动态及其在水稻土中的降解

采用ELISA技术检测了Bt水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)不同生育期茎和叶片中cry1Ab基因的表达水平,以及植株组织(茎和叶片)室内埋于不同稻田土壤中其Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态。结果表明,不论是KMD1还是KMD2,茎和叶片中cry1Ab基因的表达量为3.7～9.1μg/g鲜重,均以拔节期和孕穗期相对较低,灌浆初期显著升高,黄熟期又明显下降(但仍然维持在较高的表达量)。KMD1茎和叶片中Cry1Ab蛋白在3种水稻土即青紫泥田、黄松田和黄筋泥田中的降解,均以前期(处理后12d内)较快,但中后期明显较慢;处理后42d,这两种组织中的Cry1Ab残留量均稳定在μg级水平,分别仅有0.20～0.85μg/g干重和0.35～1.81μg/g干重。KMD1茎和叶片中Cry1Ab蛋白降解动态与土壤类型密切相关,青紫泥田中降解最快,黄筋泥田中次之,黄松田中最慢。淹水可加快土壤中茎和叶的腐解,从而促进其中Cry1Ab蛋白的降解。KMD2粉碎叶中Cry1Ab蛋白在有菌水稻土中的降解快于无菌土中,表明土壤微生物存在可加快Cry1Ab蛋白的降解。在各种土壤淹水与非淹水、灭菌与非灭菌处理条件下的Cry1Ab蛋白降解过程均可用指数方程进行拟合,算得其消减半衰期为2.2～11.6d不等。讨论了土壤类型、淹水等影响Cry1Ab蛋白降解的可能机制,认为土壤微生物是其中起关键作用的一个因子。     

转cry1Ac+cry2Ab基因棉与转cry1Ac+EPSPS基因棉荒地的生存竞争能力

【背景】此研究为"十二五"转基因生物新品种培育国家项目中创建新的转基因棉花品种环境安全评价技术而设。【方法】以转双价双Bt抗虫基因(cry1Ac+cry2Ab)棉和转双价抗虫、抗除草剂基因(cry1Ac+EPSPS)棉为观察品种,非转基因棉赣棉11号为对照品种,在荒地用撒播和3cm深度播种2种方式,于2011年5月～2012年3月对棉花出苗率、株高、生育进程、棉吐絮瓣数、絮瓣脱落率、自生苗等生存竞争能力进行比较,检测、评价其杂草化的风险,并探讨、验证检测技术的可行性。【结果】在荒地条件下,以2种方式播种的转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉与非转基因棉相比,上述各项指标的竞争能力总体上未表现显著优势。【结论与意义】转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉在荒地条件下生长无杂草化风险。同时,研究证明,在荒地自然生态条件下,可以采用撒播和3cm深度播种方法检测新的转基因棉花品种在生存竞争能力上的杂草化风险,在测评上有互为参照效应,为定性评价新的转基因棉花品种的杂草化风险提供了保障。     

转cry1Ac＋cry2Ab基因棉与转cry1Ac＋剧咯邢基因棉荒地的生存竞争能力

【背景】此研究为“十二五”转基因生物新品种培育国家项目中创建新的转基因棉花品种环境安全评价技术而设。【方法】以转双价双成抗虫基因（cry1Ac＋cry2Ab）棉和转双价抗虫、抗除草剂基因（cry1Ac＋肼强阳）棉为观察品种,非转基因棉赣棉11号为对照品种,在荒地用撒播和3cm深度播种2种方式,于2011年5月一2012年3月对棉花出苗率、株高、生育进程、棉吐絮瓣数、絮瓣脱落率、自生苗等生存竞争能力进行比较,检测、评价其杂草化的风险,并探讨、验证检测技术的可行性。【结果】在荒地条件下,以2种方式播种的转cry1Ac＋cry2Ab基因棉和转cry1Ac＋EP5P5基因棉与非转基因棉相比,上述各项指标的竞争能力总体上未表现显著优势。【结论与意义】转cry1Ac＋cry2Ab基因棉和转cry1Ac＋EPSPS基因棉在荒地条件下生长无杂草化风险。同时,研究证明,在荒地自然生态条件下,可以采用撒播和3cm深度播种方法检测新的转基因棉花品种在生存竞争能力上的杂草化风险,在测评上有互为参照效应,为定性评价新的转基因棉花品种的杂草化风险提供了保障。     

转基因抗虫作物鉴定质粒标准分子的构建与应用

苏云金芽胞杆菌基因是转基因抗虫作物中通用的外源功能基因,在绝大多数抗虫转基因作物中均有存在,然而Bt基因检测标准样品的缺乏却限制了我国转Bt基因抗虫作物检测工作的发展。为了弥补传统基体标准样品的缺失,首先将Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A 3种常用Bt外源基因克隆到pUC57质粒上,通过测序、酶切和qPCR等技术对质粒的序列和扩增功能进行了验证,然后对扩增效率和实际应用情况加以测试,评价其转基因检测的适用性,构建了质粒标准分子。结果显示,制备的质粒标准分子测序结果与靶标序列完全符合,酶切结果、qPCR扩增结果和扩增效率等均符合预期,在Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因特异性检测中的应用符合阳性对照要求,表明制备的阳性质粒标准分子能够作为转Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因qPCR基因特异性检测的阳性标准样品。     

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻对大螟幼虫体内三种保护酶活性的影响

为阐明转cry1Ab/cry1Ac基因水稻对大螟Sesamia inferens (Walker)作用的生理生化机制, 本研究用转cry1Ab/cry1Ac基因水稻茎秆饲喂大螟3龄和5龄幼虫, 采用酶活性测定方法研究了取食转Bt水稻对大螟幼虫体内3种保护酶SOD(superoxide dismutase)、 CAT(catalase)和POD(peroxidase)活性的影响。结果表明, 大螟3龄幼虫在取食转基因水稻24 h后SOD活性与对照相比提高了43.44%, 48 h后降至最低值; 在取食24 h后POD值达到最高值, 其酶活性比对照升高了29.22%, 最终在取食48 h后降至最低值, 并显著低于对照; 在取食转基因水稻4 h后, CAT活性升高了30.33%, 在取食48 h后, 与对照相比, CAT活性降低了27.01%; 5龄幼虫取食4 h后SOD活性显著高于对照水平, 36 h后降至最低值, 与对照相比, 活性下降了31.62%; 在取食8 h后POD活性达到最高值, 与对照相比, 升高了73.20%, 36 h后酶活性降至最低值; 在取食之初4 h CAT活性达到最高值, 与对照相比, 其值升高了75.73%, 在取食48 h后, 其活性与对照相比减少了7.55%。3龄幼虫与5龄幼虫相比, 对Bt的抗性水平较低, 自身防卫能力较差。结果说明, 在取食初期, 试虫体内保护酶活性升高, 以抵御Bt毒蛋白对虫体的伤害作用, 随着取食时间的延长, 保护酶活性迅速降低, 从而干扰虫体正常的代谢过程, 导致虫体出现中毒症状, 致使昆虫死亡。     

Bt水稻对褐飞虱及其二种天敌种群动态的影响

【目的】评价转cry1Ab/Ac基因抗虫水稻(华恢1号,HH1)对非靶标害虫褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)及其2种天敌(蜘蛛和黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis)种群发生动态的影响。【方法】试验分HH1处理组、亲本明恢63(MH63)组2个处理,每个处理设置3块试验田,定期调查不同处理田块内的褐飞虱及其2种天敌蜘蛛和黑肩绿盲蝽的数量。【结果】转基因水稻HH1对褐飞虱、蜘蛛和黑肩绿盲蝽的种群动态有一定程度的影响,但整个水稻生育期的试验结果显示,与亲本对照水稻MH63相比,转基因抗虫水稻HH1对上述3种非靶标昆虫均无显著差异。【结论】转cry1Ab/Ac基因水稻HH1的种植不会对褐飞虱及蜘蛛、黑肩绿盲蝽产生负面影响。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC11中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有8个核苷酸不同,编码的蛋白有7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank,并命名为新亚型基因cry1Ab16 (Ac. NO. AF375608)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab16基因克隆到Escherichia coli表达载体pQE30上并转化E. coli M15。Western印迹分析表明,E. coli M15表达了130 kD的Cry1Ab16蛋白,但此蛋白不稳定,大部分降解成65 kD的蛋白。将表达Cry1Ab16 蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾（Plutella xylostella）毒力测定,其LC50为258.3mg/L;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。     

利用花青素可视化跟踪表达系统快速筛选表达Cry1Ab/c基因的转基因玉米

以草甘膦抗性基因Epsps为标记基因, 在原核Kan^r基因两侧引入Cre(环化重组酶)基因识别的Lox-P位点, 同时以编码花青素合成转录因子的Bi和Cl基因为可视化选择报告基因, 构建了Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/c的可视化跟踪表达载体pBAC9017。用PDS1000/He基因枪转化玉米(Zea mays)自交系501的幼胚和胚性愈伤组织, 获得147个草甘膦抗性的玉米再生植株。其中106棵植株获得了结实种子, 16棵植株的结实种子有紫红色花青素基因的表达。经PCR检测表明, 外源Cry1Ab/c基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株种子蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条和ELISA检测, 结果表明, Cry1Ab/c在部分转基因植株后代中表达。     

南繁条件下转基因水稻对根际土壤微生物的影响

【背景】随着转基因技术的发展,转基因作物的安全评价已经成为目前的研究热点。海南省南部三亚、乐东、陵水等地形成的南繁育种区是我国的＂种业硅谷＂,其天然气候与环境优势,为加速世代繁殖、缩短育种年限提供了条件。大量的育种材料汇集于南繁区域,在利用南繁优势的同时,也造成了潜在的生态风险,因而在南繁区开展转基因生物安全评价研究具有重要的意义。【方法】采用平板培养计数和分子鉴定手段,对海南三亚南繁区种植的转cry1 Ab/cry1 Ac基因水稻TT51及其对照常规水稻明恢63（MH63）的根际土壤微生物进行了监测。【结果】连续3个种植周期（42个采样时间点）的监测发现,TT51与MH63根际土壤微生物数量变化趋势基本一致,说明转基因水稻未对根际土壤微生物数量变化趋势造成明显影响。TT51与MH63根际土壤细菌类群主要种属组成一致。【结论与意义】种植转cry1 Ab/cry1 Ac基因水稻TT51不会对根际土壤微生物数量和种类组成造成明显影响。本研究可为在我国南繁育种区开展转基因水稻安全评价提供数据支持。     

转Bt基因水稻对白符跳虫适应低温环境与排泄的影响

【目的】为探讨转基因Bt水稻种植对土壤重要分解者跳虫的潜在生态风险性。【方法】将同一非转基因亲本插入3种不同的Bt基因(cry1C、cry2A、cry1Ab/Ac)的转Bt基因水稻叶片残体饲养白符跳虫Folsomia candida,通过放入不同低温环境下观察其存活率和粪便排泄速率以分析白符跳虫取食Bt水稻叶片后的适应低温行为。【结果】结果表明,3种转Bt基因水稻相对于非转基因亲本水稻品种而言,不会影响白符跳虫的适应低温环境;而不同Bt基因插入后导致的水稻成分的变化可能影响了白符跳虫对水稻残体的偏好性,进而影响其在低温环境下的适应行为。【结论】结果可为评估转Bt水稻对土壤生态系统影响提供参考价值,为转Bt水稻安全性评价提供科学的依据。     

农杆菌介导Bt基因遗传转化高粱

高粱是全球仅次于小麦、水稻、玉米、大豆和马铃薯等的重要作物之一。以高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法和含有抗潮霉素和gus基因的双元载体将杀虫晶体蛋白基因cry1Ab导入高粱品种115、ICS21B和5-27,经Hyg筛选共获得21个独立的转基因株系,52株转基因植株,平均转化率为1.9%。经PCR、Southern杂交和RT-PCR分析表明cry1Ab基因已整合入高粱基因组中并得到正确转录。Bt蛋白Westernblotting分析和ELISA定量测定显示,cry1Ab基因在转基因高粱植株中表达,但不同转基因植株表达量有差异。饲虫试验表明,转基因高粱对大螟(Sesamiainferens)具有一定抗性。     

抗虫耐除草剂转基因玉米SW-1目标性状测试及多重PCR检测

以转基因玉米IE034和12-5为亲本,通过杂交复合获得同时含有cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs基因的复合性状转基因玉米SW-1。农艺性状检测证明SW-1同时具有抗虫和耐除草剂的特性。通过引物特异性筛选、退火温度和引物浓度等条件优化,建立了SW-1的多重PCR检测体系。多重PCR检测体系所用的内标基因为zSSIIb,反应体积为30μL,最佳退火温度为62℃,各引物加入量为0.3μL(10μmol/L)。利用此多重PCR检测体系,当产品中SW-1的质量百分比超过0.5%时,目标基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs都能同时被检测出来。研究结果为复合性状转基因玉米SW-1的分子特征检测提供了良好的技术支撑,同时也为含有cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs基因的其他转化体的多重PCR检测提供了科学数据。     

转cry1Ab基因抗虫水稻的田间试验

采用农杆菌介导的遗传转化技术, 将Bt基因cry1Ab导入三系恢复系明恢63获得了一批抗虫性及农艺性状较好的转基因纯合株系。研究中, 进一步检测了这些纯合株系的拷贝数、Bt蛋白含量、抗虫性及主要农艺性状。结果显示: 5个转基因纯合株系均为单拷贝; 纯合株系T_1Ab-10及其杂种的Bt蛋白含量最高; 人工接虫和自然感虫试验中, T_1Ab-10对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟均表现高度抗性; 喷药试验中, 阳性植株与阴性植株、对照植株的主要农艺性状均没有显著差异。这说明转cry1Ab基因纯合株系T_1Ab-10具商品化潜力, 可作基因聚合材料。     

转修饰cry1Ac基因籼稻明恢81经花药培养获得抗虫DH系

对基因枪法获得的明恢81转修饰的cry1Ac基因当代植株进行花药培养,共接种花药2600枚,获得83份花培植株,其中双倍体植株43份,单倍体植株40份,PCR结果表明含有cry1Ac基因的植株55份,花培植株群体中转基因与非转基因植株的比值为2：1（55／28）,进一步结合Southern blot和ELISA分析,于花培植株当代筛选到转基因纯合株系36份,外源蛋白表达量上,花药来源于同一克隆的DH系的不同植株之间基本一致,最高的Cry1Ac含量达0．25％,田间抗虫性试验表明,经花药培养纯合获得的部分转基因纯合系植株对二化螟（chilo suppressalis)表现出高抗,而且主要农艺性状保持不变,以上结果表明水稻花药培养可以加速转基因的纯合与良种利用。     

不同地区转Bt基因抗虫水稻稻谷对赤拟谷盗生长发育的影响

为了明确来自湖北武穴、孝感、随州3个不同地区的转cry1Ab/cry1Ac、cry2A、cry1C基因明恢63(分别命名为TT51、T2A-1和T1C-19)对赤拟谷盗Tribolium castaneumHerbst生长发育的影响,在室内以不同的转Bt基因稻谷继代饲养赤拟谷盗6代,结果表明:各处理赤拟谷盗的卵期3～4d,卵孵化率85%～100%,幼虫期22～27d,化蛹率85%～97%,蛹期6～7d,百蛹重0.25～0.31g,性比0.8～1.4,羽化率82%～97%,产卵前期5～7d。不同抗虫转基因水稻对赤拟谷盗各发育历期及生命表参数没有显著的影响,同一转基因事件,没有因为种植地区的不同造成对赤拟谷盗生长发育的差异。3种Bt蛋白在继代饲养的赤拟谷盗幼虫体内检测均呈阳性反应,但积累量很小,继代饲养后,没有发现在赤拟谷盗体内明显的累积。     

转基因水稻中转录水平cry1Ab 基因的沉默及其阶段复活

以田间环境释放条件下农杆菌介导法转化而成的转cry1Ab 基因水稻为研究对象, 利用GUS组织化学染色法、Western杂交技术, 在不抗虫转基因中8215株系后代中筛选到一个无cry1Ab 蛋白表达产物株系. 分子杂交结果证实, 转基因cry1Ab 在中8215株系后代中发生了转录水平沉默, 整合过程中基因重排使两个拷贝的ubiquitin启动子同时插入到水稻基因组中. 甲基化分析证实ubiquitin启动子区域发生了甲基化, 从而导致cry1Ab基因沉默. 利用去甲基化试剂5-氮胞苷处理转基因沉默水稻种子, 并在苗期、分蘖期、孕穗期、灌浆期及成熟期检测了其对沉默基因的复活效应, 结果表明：5-氮胞苷处理使沉默的cry1Ab 基因在灌浆期恢复表达活性, 复活率约为8%~30%, 且以低浓度(45 mg/L处理1, 2 d)处理的复活率及恢复表达水平较高, 复活基因表达的cry1Ab 蛋白最高可达可溶性总蛋白的0.147%.