人IL-6基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建人白细胞介素6(IL-6)的原核表达载体并优化其表达条件,为IL-6的高效表达提供试验依据。以人T细胞cDNA为模板通过PCR方法扩增IL-6基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用Western blotting及人IL-6检测试剂盒分析鉴定。在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、卡那霉素浓度、培养温度等来优化IL-6表达条件。结果显示,原核表达载体pET28 a(+)-IL-6成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约22 kD的IL-6蛋白,经Western blotting鉴定正确,经人IL-6试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。在IPTG浓度400μmol/mL,卡那霉素浓度50μg/mL,40℃培养6 h的条件下,目的蛋白表达量最高,可占总蛋白表达量的40%。成功构建人IL-6原核表达载体且获高效表达,为研究IL-6生物学活性及产品开发提供了试验基础。     

人IL-6 /sIL-6R 结合分子模型的建立及在药物筛选中的应用

目的：建立人IL-6 /sIL-6R 结合的分子模型,用于筛选IL-6 /sIL-6R的抑制剂。方法：将人IL-6基因克隆至原核表达载体pET28a（+）中表达IL-6蛋白,western blot及人IL-6检测试剂盒分析鉴定表达蛋白。同法将人sIL-6R在pET15b载体中表达,纯化并用western blot检测目的蛋白。依据ELISA原理建立IL-6 /sIL-6R 结合的分子模型,并通过改变IL-6、sIL-6R及IL-6 antibody的浓度来优化该模型,用于IL-6 /sIL-6R拮抗药物的筛选。结果：人IL-6可在载体PET28a（+）中高效表达,且经western blot鉴定正确,人IL-6检测试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。sIL-6R在PET15b中表达,western blot鉴定正确。通过对IL-6 /sIL-6R结合的分子模型的优化,得到其最佳条件为：IL-6R 1?g/well, IL-6 500ng/well, IL-6 antibody 1?g/well。应用该模型筛选发现有些化合物可显著抑制IL-6与其受体的结合。结论：成功构建IL-6 /sIL-6R结合的分子模型,为高通量筛选IL-6拮抗剂提供平台。     

HIV-1 gp160多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的免疫原性分析

HIV感染引起的AIDS已经成为严重影响人类健康和社会发展的全球性疾病。酶联免疫吸附试验和免疫印迹检验组合则被认为是HIV检测的“金标准”。因此本实验构建gp160的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达, 为HIV抗体测定提供特异、价廉的抗原。选定HIV-1 gp160基因中三个片段包含较多抗原表位的区域, 设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这三个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性, SDS-PAGE和Western Blot测定融合蛋白的抗原特异性。构建的HIV-1 gp160多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长969bp。在大肠杆菌BL21(DE3) 中高效表达的重组蛋白分子量为37kDa,以包涵体的形式存在。应用western blot测定10例正常人和12例HIV/AIDS病人血浆显示HIV-1 gp160多表位融合蛋白具有良好的抗原特异性。成功构建了高表达 HIV-1 gp160多表位蛋白的原核表达系统,纯化的融合蛋白有较强的抗原特异性。