基因枪技术及其在基因治疗中的应用进展

目前基因转染载体主要分为病毒型载体和非病毒型载体,病毒载体虽转染率较高、表达时间长,但其安全性令人担忧,非病毒载体中基因枪的优势最为明显,临床化趋势最强。通过分析非病毒基因转染技术面临的障碍,介绍了基因枪技术的产生和原理及其显著的优势,并总结了当前基因枪技术在基因治疗中的应用,指出了基因枪技术发展面临的问题和发展方向。     

阳离子聚合物在非病毒基因转染中的研究进展

基因治疗为治疗先天性遗传疾病和严重后天获得性疾病提供了一条新途径.目前,基因载体分为两类:病毒载体和非病毒载体.病毒载体转染效率高,但由于某些病毒载体存在免疫原性、致癌性、宿主DNA插入整合等缺点,从而限制了它们的应用.非病毒载体具有价格低、制备简单、安全有效、无免疫原性等优点,成为基因载体研究的热点.阳离子多聚物是非病毒载体的典型代表.文中综述近年来阳离子多聚物作为基因载体的研究现状和进展,重点介绍了阳离子多聚物基因载体的分类和与DNA的相互作用和传递机制.     

体内基因转染技术在肝再生研究中的应用

肝脏是一个特殊的器官,不仅因为它独特的解剖结构和生理特征,而且它还具有无限的再生能力。在各种动物模型中,应用病毒或非病毒载体将肝细胞生长因子等基因转入体内,能增强肝再生能力,这就是肝脏基因转染技术在肝再生研究中的应用。未来的研究目标就是消除病毒载体的毒副作用和增加非病毒载体的转染率,这也是目前肝内基因转染技术中面临的主要难题;另一个研究目标就是用受体介导基因靶向肝转染,使转入基因在肝细胞中特异高表达。这些研究成果将有助于肝再生基因机制研究,以及将来临床基因治疗提供参考。     

常用病毒载体转染对树突状细胞的影响

树突状细胞是功能最强的抗原提呈细胞,在介导免疫应答和维持免疫耐受中起着极其重要的作用。用携带目的基因的病毒载体转染树突状细胞已广泛应用于抗肿瘤和诱导耐受等方面的治疗。但在病毒载体转染树突状细胞过程中,病毒本身常能影响树突状细胞作为抗原提呈细胞的功能。因此,了解各种病毒载体的特点和对树突状细胞产生影响的作用机制,并选用合适的病毒载体,成为针对DCs进行基因治疗成功的关键。     

磁性纳米颗粒作为载体在基因转染中的研究进展

磁性纳米颗粒具有很强的结合、浓缩与保护DNA的作用,具有超顺磁性、较高的安全性和低的免疫原性,可以结合大片段DNA,在外加磁场的作用下可实现安全、高效的基因靶向性运输,提高外源基因的转染效率。由于磁性纳米颗粒的独特性质,使得其作为非病毒载体在基因治疗中的应用进展迅速。我们简要介绍磁性纳米材料的特点、种类及结构,磁性纳米基因载体的特点,以及磁性纳米颗粒作为载体在基因转染中的应用情况。     

慢病毒载体pITA-HBP1的制备及感染效率的测定

慢病毒载体是目前基因治疗中研究较多的载体,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,它有感染非分裂期细胞及容纳大片段外源性目的基因等优点.本文应用基因重组的方法,构建了1种新型的慢病毒载体,并将转录因子HBP1基因插入到这一载体上,成为pITA-HBP1.检测其在人的肿瘤细胞和正常细胞中的转染效率,发现转染效率明显增加,Western印迹证实外源基因得到高效表达.这一结果,对今后实验室提高基因的转染效率、表达水平,以及研究基因的表达调控,都提供了重要的技术方案.     

慢病毒载体pITA-HBP1的构建及感染效率的测定

慢病毒载体是目前基因治疗中研究较多的载体, 与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较, 它有感染非分裂期细胞及容纳大片段外源性目的基因等优点.本文应用基因重组的方法,构建了1种新型的慢病毒载体,并将转录因子HBP1基因插入到这一载体上,成为pITA-HBP1.检测其在人的肿瘤细胞和正常细胞中的转染效率,发现转染效率明显增加,Western 印迹证实外源基因得到高效表达.这一结果,对今后实验室提高基因的转染效率、表达水平,以及研究基因的表达调控,都提供了重要的技术方案.     

非病毒基因治疗的研究进展

非病毒基因治疗是相对于病毒性基因治疗而言,指采用非病毒的载体进行的基因治疗。非病毒的基因载体比病毒性基因载体具有高安全性、低免疫原性及易于生产的特点。本文就非病毒基因治疗所采用的主要方法、面蜂的主要问题及发展方向作一概括的介绍。随着人类对疾病发病分子机制的深入研究及人类基因组计划的实施,非病毒基因治疗将在人类疾病的治疗中发挥重要作用。     

低毒病毒及板栗疫病菌低毒力机制

低毒病毒是一类存在于板栗疫病菌细胞质中自主复制的无衣壳正链RNA病毒.感染低毒病毒后,板栗疫病菌的致病力显著降低,色素分泌减少,菌丝体由感染病毒前的桔黄色变为白色,产孢量降低或不产孢,漆酶表达水平明显下降.低毒病毒侵染性克隆的获得以及高效转化和转染体系的建立,使得低毒病毒成为目前唯一可以进行全面遗传操作的真菌病毒.利用低毒病毒作为探针来探测板栗疫病菌的致病力组成和毒力调节机制,已获得了一些很有意义的发现.本文介绍近几年低毒病毒及其与真菌相互作用的研究进展,包括低毒病毒的基因组和功能基因研究、低毒病毒和线粒体损害引起的板栗疫病菌低毒力机制、板栗疫病菌的RNA沉默系统以及低毒病毒抗RNA沉默的机制.低毒病毒/板栗疫病菌系统已经成为研究病毒与宿主相互作用以及病原真菌致病机理的很好的模式系统.     

可降解的非病毒基因载体的研究进展

选择合适的基因载体是基因治疗成功与否的一个关键环节,合适的基因载体应该具备较高转染效率,较好的组织相容性以及生物安全性等特点。相较于传统的病毒基因载体,非病毒基因载体具有低免疫原性,易于制备以及载药量大等特点,是较为理想的基因载体。而寻求可降解的非病毒基因载体可使其更为安全深入的应用到体内以及临床,意义重大。本研究就对常见的几种可降解的基因载体的转染效果及相关改性做一综述,为研究可降解非病毒基因载体的新方法提供新思路。     

高分子纳米材料基因载体研究进展

有数千种人类疾病与基因突变有关,治疗基因突变的新型有效方法是基因治疗,而高效、低毒、靶向的基因载体是治疗成功的关键。与病毒载体相比,非病毒载体中高分子纳米材料除了相对毒性低、转载量大外,还具有储存稳定、结构灵活、合成和形状易控制等优势,因而成为研究热点之一。我们对高分子材料的纳米基因载体种类、性质和表面修饰等研究进展做简要综述。     

ShRNA慢病毒表达载体的构建和病毒颗粒包装

<正>慢病毒载体主要用于感染对常规方法转染效率较低的细胞,如原代细胞等。慢病毒颗粒可同时感染增殖和非增殖的细胞,且感染比较稳定、持久。运用慢病毒载体,可实现特定基因的高表达,也可以表达ShRNA以RNAi方式下调某基因的表达。本文主要介绍ShRNA慢病毒表达载体的构建和病毒颗粒包装。实验步骤如下:     

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠软骨细胞表达研究

目的:慢病毒载体是一种逆转录病毒载体,可将目的基因稳定整合入宿主基因组、感染非分裂期细胞,现已成为基因工程中转移目的基因的理想载体.软骨细胞可定向成软骨,是软骨基因工程中理想的靶细胞.本文以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因作为报告基因,探讨慢病毒介导的GFP基因转染大鼠膝关节软骨细胞的最适病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)、转染效率,以及转染GFP后是否对关节软骨细胞增殖代谢活动产生影响,为下一步实验提供理论基础.方法:常规大鼠膝关节软骨细胞原代、传代培养,应用携带GFP基因的慢病毒载体转染软骨细胞.在软骨细胞培养状态最佳时,以不同MOI值(分别设定为10,20,50,100)进行慢病毒转染实验,96h后在荧光显微镜下观察GFP在软骨细胞中的表达情况,确定最佳MOI值,流式细胞术检测慢病毒转染效率,MTT法绘制生长曲线比较携带GFP基因的慢病毒对软骨细胞增殖能力的影响,以评价GFP慢病毒载体系统转染大鼠膝关节软骨细胞的高效性和稳定性.结果:置荧光显微镜下,转染96 h后,部分软骨细胞可见绿色荧光.其中当MOI=50时,慢病毒转染软骨细胞效率最高,且对软骨细胞生长状态无显著性影响,GFP阳性细胞率(转染效率)为90.1％,MTT法测生长曲线结果显示,与未转染GFP基因的对照组相比,慢病毒转染组对软骨细胞增殖活性没有显著影响(P＞0.05).结论:慢病毒介导的GFP基因转染大鼠膝关节软骨细胞的最适MOI值为50,携带GFP基因的慢病毒能高效转染大鼠膝关节软骨细胞并稳定表达,同时不影响其生物学特性,为将来应用慢病毒载体对大鼠软骨细胞进行基因改造提供了理论基础,也可作为可靠的转基因研究示踪方法,为进一步研究关节软骨疾病的治疗提供了有力依据.     

小鼠Smad6基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

构建小鼠Smad6基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,有效沉默骨髓树突状细胞（BMDC）的Smad6基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于哮喘等自身免疫疾病的研究。设计小鼠Smad6 shRNA序列,合成、退火,得到双链DNA,与经酶切后的Psih1-H1-copGFP shRNA Vector载体连接产生LV-shSmad6慢病毒载体,并测序鉴定。转染293TN细胞,包装产生慢病毒,测定滴度。感染小鼠骨髓树突细胞,检测Smad6基因的表达状况成功构建Smad6 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad6。包装慢病毒,并显著抑制Smad6 mRNA水平及蛋白水平的表达。成功构建出小鼠Smad6基因shR-NA慢病毒载体,为后期研究Smad6基因在哮喘发病机制及新治疗方法提供了稳定的转染细胞载体。     

Duchenne肌营养不良基因缺陷及基因治疗

Duchenne肌营养不良(DMD)是常见的神经肌肉遗传病之一,由于骨胳肌肌膜上的抗肌萎缩蛋白(dys—trophin)完全或部分缺失引起。本文介绍了dystrophin的结构和功能,对DMD基因治疗的目的基因。基因治疗方式(包括病毒载体和非病毒载体)。基因转染途径作了较为全面的介绍,指出腺相关病毒载体介导的基因治疗及干细胞移植是有希望的治疗方向。经全身途径使目的基因广泛转染骨胳肌并实现心肌和膈肌的转染,是基因治疗研究的难点。     

造影剂、超声波介导的基因治疗技术

目前基因治疗受阻于缺乏安全有效的载体。病毒类载体和非病毒类载体最大的不足之处在于不安全和转染效率低。超声波作为一种物理转染方法会造成组织损伤。近年来,超声造影剂的出现使研究者对超声波介导的基因转染技术有了新的认识。微气泡作为一种超声造影剂能携带基因物质,在超声波的作用下,“载体”微泡破裂,并在经超声辐照的区域高浓度释放其所携带的基因物质。同时,微气泡破裂会导致局部组织细胞膜通透性增高,从而使外源性基因更易被摄取。     

腺病毒载体与慢病毒载体感染骨髓间充质干细胞的比较

随着基因治疗的发展,建立高效稳定表达目的基因的载体和靶细胞成为目前研究的热点.骨髓间充质干细胞具有自我复制,高度的增殖能力,多向或定向分化的潜能等优势,是细胞和基因工程中的理想靶细胞.而腺病毒载体和慢病毒载体作为基因载体均能将目的基因导入宿主细胞,因此对腺病毒载体和慢病毒载体的结构、分类、优缺点以及感染骨髓间充质干细胞的转染效率等方面做简要的分析.     

腺病毒及腺病毒相关病毒载体与基因治疗

腺病毒及腺病毒相关病毒能感染增殖与静止的细胞,宿主范围广,其稳定,安全滴度高,转染效率高,腺病毒载体能承载较大的外源基因,腺病毒相关病毒载体能定向整合入靶细胞基因组内等特点,使腺病毒及腺病毒相关病毒载体成为体内用于基因治疗的理想运载系统。     

基于造血干细胞为靶细胞的基因治疗

在基因治疗中,造血干细胞因为具有自我更新及分化为各种血细胞系的能力而成为一种很有吸引力的靶细胞。将外源目的基因导入造血干细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,特别是血液疾病已取得重要进展,例如:腺苷脱氨酶缺陷病、血友病、地中海贫血症及镰状细胞性贫血症等。而慢病毒以其转染效率高,能够感染非分裂期细胞的特点成为转染造血干细胞的最适合载体,本文就造血干细胞的特性、载体的选择及临床应用和基因治疗的安全性等方面作一综述。     

阳离子脂质体的转染机制及转染效率影响因素

阳离子脂质体是一种非常具有发展前景的基因载体。简要介绍了阳离子脂质体的结构特点;着重讨论了阳离子脂质体作为基因载体时介导基因转移的机制以及在转染过程中对基因转染效率产生影响的主要因素。