4C-克隆筛选过程中的质量控制

环形染色体构象俘获(Circular chromosome conformation capture,4C)是一种高通量研究细胞染色体相互作用、空间构象的技术。文章通过模拟的4C样品,优化反向PCR条件,建立了高效、特异的扩增方法,对4C克隆筛选等后续步骤进行严格的质量控制并对该方法的可行性进行了实例验证。该4C-克隆筛选方法作为4C方法的质量控制标准,具有重要的指导和监测作用。     

农杆菌介导的马尔尼菲青霉基因转化技术的建立及优化

目的建立农杆菌介导的马尔尼菲青霉(PM)基因转化技术,并对该技术条件进行优化。方法以二元质粒p DHt/SK为载体,通过农杆菌介导将pyr G基因插入马尔尼菲青霉尿嘧啶缺陷株SPM4(pyr G-,nia D-)中,在不含尿嘧啶的培养基中筛选阳性转化子。运用PCR验证重组子。进一步对影响转化效率的农杆菌类型、共培养浓度、转化媒介、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等六个条件进行优化。结果 PCR验证pyr G基因成功的插入SPM4中,所得到转化子可稳定传代,通过条件优化,得到转化子约300个/106个细胞。选用AGL-1,以农杆菌共培养浓度为OD600=0.8,AS浓度为200μmol/L,无膜IM固体共培养基为介质,25℃共培养48 h为最适转化条件。结论成功建立了农杆菌介导PM基因转化技术,简化并优化了转化条件,该方法可用于PM基因功能研究。     

重组人胸腺素β4生物学活性测定方法的建立

目的:建立适用于重组人胸腺素β4(rhTβ4)体外质量控制的生物学活性测定方法,用于该制品的生物学活性评价。方法:利用ECV304细胞迁移法,摸索细胞密度、玻连蛋白(Vn)浓度、rhTβ4浓度等影响因素,并对试验条件进行优化及方法验证。结果:细胞密度为0.5×104/孔、Vn浓度为12.5μg/mL、rhTβ4浓度为200nmol/L、孵育时间24h和细胞迁移时间4h时,细胞迁移率较高。结论:建立了rhTβ4生物学活性测定方法,该方法专属性强、重复性好、准确性高,可用于rhTβ4生物学活性测定。     

响应面法优化L-谷氨酰胺发酵培养基的研究

目的:采用响应面法对L-谷氨酰胺发酵培养基成分进行优化,以提高L-谷氨酰胺发酵产量。方法:首先利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响L-谷氨酰胺产量的主要因素葡萄糖、玉米浆和(NH4)2SO4,在此基础上采用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,并利用中心组合设计及响应面分析法进行回归分析。结果:通过求解回归方程得到L-谷氨酰胺发酵培养基最佳浓度为葡萄糖100 g/L、玉米浆4.5 ml/L、(NH4)2SO437.2 g/L,L-谷氨酰胺产量理论最大值达41.0 g/L。结论:经模型验证,预测值与验证试验平均值接近,在优化条件下谷氨酰胺产量提高了37.6%。     

高粱抗丝黑穗病SSR-PCR反应体系的优化

目的:找到一种可用于高粱抗丝黑穗病SSR-PCR扩增最适宜的反应体系。方法:利用单因素体系优化的方法,对SSR-PCR反应体系中Taq酶、dNTPs、MgCl2、模板DNA以及引物用量进行了优化,并且用不同引物、不同模板DNA对该优化结果进行验证。结果:实验表明,Taq酶、dNTPs、MgCl2、模板DNA以及引物的不同用量均对PCR反应结果有显著的影响。最适宜高粱抗丝黑穗病20μl SSR-PCR的反应体系为1U/μl Taq酶2.5μl,10mmol/L dNTPs 1.0μl,25mmol/L MgCl21.5μl,模版DNA2.0μl(50ng),10μmol/L引物1.5μl,10×Buffer 2.0μl。验证结果表明,该体系扩增出的条带清晰且稳定。结论:该结果为今后利用SSR-PCR标记技术研究分析高粱抗丝黑穗病奠定了基础。     

研究报告: 基于遗传算法的计算机辅助策略优化孕酮适配体

目的 本研究致力于优化孕酮（progesterone，P4）适配体的亲和力和选择性。方法 基于遗传算法（genetic algorithm，GA）的计算机辅助优化策略（in silico maturation，ISM），进行了4轮GA操作（含交叉变异、单点突变和双点突变操作），构建了初始文库和G1、G2、G3代ssDNA作为新的候选适配体库，采用分子对接对候选适配体进行筛选和分析，并使用迭代策略不断优化适配体。此外，还提出了一种较为准确预测ssDNA三级结构的方法，首先使用Mfold预测二级结构，继而使用RNAComposer建立与ssDNA相对应的RNA三级结构，输出的PDB文件使用Discovery Studio将RNA修改为DNA，最后使用Molecular Operating Environment对结构进行能量最小化处理。结果 到G2代，在局部搜索空间对P4S-0进行优化，筛选出P4G1-14、P4G2-20、P4G1-6、P4G1-7和P4G2-14这5条适配体作为P4的最佳候选适配体。采用AuNPs比色法初步验证优化后适配体的亲和力，继而构建了基于适配体结构开关的荧光法测定适配体的解离常数（equilibrium dissociation constant，K_D），并以此方法对适配体的选择性（对双酚A、雌二醇、睾酮和皮质醇）进行了评估。结论 通过ISM优化后的适配体，对P4的亲和力较原适配体有了较大提升，仍保留着识别结构类似分子的选择性。     

小麦内源特异参照基因的查找与定性PCR和实时荧光PCR验证

目的:先从理论上查找和比对了小麦属(Triticum)γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法从实验特异性上进行了验证。方法:选择小麦基因组中部分基因序列在NCBI中进行同源性分析,查找在小麦中存在的内源特异参照基因,找到小麦属(Triticum)特异的γ-醇溶蛋白基因(GAG56D),设计并合成该基因的引物和探针序列,同时用定性PCR和实时荧光PCR方法进行检测,并优化了实验条件。结果:不仅在理论上查找和比对了γ-醇溶蛋白基因为小麦特异的内源基因,并用定性PCR和实时荧光PCR方法进行了实验特异性的验证。定性PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,只在小麦属中可以检测到328bp的目的片段,而在其它作物中未扩增出目的片断。同样实时荧光PCR验证的结果小麦属内各个种均有扩增曲线出现,而在其它作物没有扩增曲线出现中。结论:该基因与方法可用作检测小麦属(唯一小麦种是栽培作物)内源特异参照基因。     

火箭电泳法进行人用狂犬病疫苗抗原的检测

应用火箭电泳法(RIE)建立并优化了人用狂犬病疫苗抗原的检测方法。以传统的动物NIH法对电泳结果进行验证,实验结果显示该方法特异、重复性好、简便易行,与NIH法有较好的相关性。适用于人用狂犬病疫苗中间品抗原的检测,对人用狂犬病疫苗的生产及质量控制有重要意义。     

产朊假丝酵母全细胞转化合成谷胱甘肽的营养条件

为了进一步提高产朊假丝酵母全细胞转化生物合成谷胱甘肽(GSH)的能力,利用响应面分析方法对酵母培养的发酵培养基进行优化。在单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman设计筛选出显著影响GSH转化力的2个主要因素:葡萄糖和KH2PO4。采用最陡爬坡试验和响应面设计预测了葡萄糖和KH2PO4的最佳质量浓度分别为58.5和17.2 g/L。验证实验结果表明,在该优化培养基条件下,酵母细胞的GSH转化力为1.54 mg/(g·h),比优化前提高了1倍。该结果为类似的采用全细胞转化法高效合成有用化学品的研究与开发提供了可行的优化思路。     

金黄杆菌ZHDP1菌株基因组分析及其蛋白酶活性特征与产酶优化

【背景】蛋白酶活性研究对于理解金黄杆菌属（Chryseobacterium）菌株的生态角色、工业价值及潜在致病机理十分重要。【目的】分析一株细菌的新型基因组序列,以此推断其中潜在的蛋白酶基因,并对其蛋白酶活性进行验证与优化,为后续研究提供数据支撑。【方法】利用高通量测序技术对菌株基因组序列进行测定与组装,并利用单因素优化方法对菌株的蛋白酶作用条件与产酶条件进行优化。【结果】分离得到一株蛋白酶活性菌株,通过分子生物学手段鉴定为金黄杆菌属菌株,并命名为Chryseobacterium sp. ZHDP1。该菌株基因组大小为4 917 748 bp,GC含量为35.95%,平均核苷酸相似性和DNA-DNA杂交指数分别为91.39和47.8。该菌株基因组中发现超过20条蛋白酶基因,上清液中也检测到蛋白酶活性,其最适反应温度和pH值分别为50℃和7.0。Zn²⁺、Mn²⁺和Cr₂O₇^2-对蛋白酶活性有强烈抑制作用。ZHDP1菌株在培养温度35℃、培养时间35 h、接种量4%、碳源和氮源为...     

总有机碳分析在制药设备清洁验证中的应用

目的证明总有机碳(Total organic carbon,TOC)分析是适用于清洁验证的分析方法之一。方法以生产中最常用的DMEM干粉培养基代替生产过程的残留物,采用了擦拭法,并用TOC分析仪检测该法清洁验证的样品的结果。结果采用TOC法分析检测DMEM培养基溶液,得到良好的线性,r0.99,回收率为98%~106%,RSD为2.07%~3.88%。检测限和定量限的TOC响应值分别为56和168μg/L。擦拭样品回收率为86.40%,样品放置1、4、8、24、30、48 h测出的TOC响应值之间的RSD为2.49%。结论该方法的线性、精密度、准确度、材料稳定性等均符合规定,方法简便、快捷,适用于制药设备的清洁验证。     

CA16滴度微量检测方法的建立及其验证

目的建立用Vero细胞检测柯萨奇病毒A组16型(CA16)滴度的方法,并对其适用性进行初步验证。方法通过对细胞种类的选择、细胞接种浓度和细胞病变判定时间的优化,建立测定CA16滴度的半数细胞感染剂量法(CCID50法),并对其进行初步验证。结果通过对病毒感染后细胞病变情况的观察,确定了以Vero细胞作为CA16病毒滴度检定用细胞。Vero细胞的最佳接种浓度和结果判定时间分别为5×104~1×105细胞/mL(即96孔板内每孔加入的最终细胞量为5×103~1×104细胞)和7 d。由4组人员对6批CA16病毒液进行重复检测,实验结果表明不同实验人员测定结果的变异系数(CV)在1.739%~4.974%之间,说明该方法测定结果重复性好,准确度高。结论该法简便、稳定,可以灵敏、准确地检测CA16病毒的滴度,可用于相关疫苗生产过程中的质量控制。     

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法检测A、C、Y和W135群脑膜炎球菌多糖含量

目的用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定A、C、Y和W135群脑膜炎球菌多糖含量,并对该方法进行验证及初步应用。方法采用Carbo Pac~?PA-1 4×250 mm分析柱与Aminotrap 4×50 mm保护柱;使用氢氧化钠/醋酸钠梯度洗脱,以多糖抗原标准溶液质量浓度为横坐标,其相应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,并对建立的方法进行专属性、精密度和准确性验证;同时与传统方法的检测结果进行比较分析。结果 A、C、Y和W135群脑膜炎球菌多糖质量浓度在0.5～27.0μg/m L范围内与峰面积均具有良好线性关系,r=0.999。该方法专属性高,分析结果重复性良好,RSD均5%;回收率均在95%～105%范围内;与传统的火箭免疫电泳法相比,检测结果差异均无统计学意义(P0.05)。结论 HPAEC-PAD准确、可靠,重复性好,可用于检测脑膜炎球菌多糖原液及疫苗成品中的多糖含量。     

甲型肝炎病毒滴度检测方法的优化与验证

目的对优化后的甲型肝炎病毒滴度检测方法进行验证。方法分别使用甲型肝炎病毒滴度检测的常规方法(每个细胞培养瓶中加入胰酶消化,收集后经超声破碎、氯仿抽提、聚乙二醇6000浓缩等步骤,收获病毒。滴定期间病毒在35℃吸附4 h,中间轻摇2次)和优化方法(在每个细胞培养瓶中加入1%Triton X-100 1 mL,置35℃培养箱中30～40 min,收获病毒。滴定期间病毒在35℃吸附1.5 h,中间轻摇1次)进行滴度检测,同时对优化后的方法进行包括重复性、中间精密性(准确性)及特异性(专属性)的方法学验证,并使用SPSS 20.0统计学软件对试验数据进行统计分析。结果不同吸附时间的病毒增殖培养实验病毒滴度3次检测结果均在8.33～8.50之间,显示优化方法与常规方法一致。优化方法的重复性验证中,取6批样品,分别检测3次,检测结果差异均无统计学意义(P1_((第1次与第2次))=0.694,P2_((第2次与第3次))=0.694,P3_((第1次与第3次))=1.000,P0.05);中间精密性(准确性)验证中,2组实验人员分别使用常规方法和优化方法进行病毒滴度检测,其检测结果差别较小,组间差异无统计学意义(P=0.599,P0.05);特异性(专属性)验证中,用常规检测方法及优化后的检测方法同时检测6批样品,其检测结果差异无统计学意义(P=0.203,P0.05)。结论甲型肝炎病毒滴度检测优化方法可以代替常规方法进行滴度检测。     

响应曲面法优化伽师瓜皮果胶的微波辅助提取工艺

目的：提高伽师瓜副产物—瓜皮的利用价值。方法：伽师瓜皮为试验材料,经晾晒3d并在烘箱65℃的条件下存放24h,处理后的伽师瓜皮呈薄脆状态时效果较佳。以微波时间、pH值料液比为自变量,分别比较三者对其果胶提取率的影响,应用响应面法进行优化,并验证优化方案。结果：伽师瓜皮果胶的最适提取工艺参数为萃取液pH值为35、料液比1∶40、微波加热时间为70s,此时伽师瓜皮果胶提取率为483%。结论：该工艺可以有效地提取伽师瓜皮中的果胶。     

基于心脏模型推断心肌病理状态的仿真研究

采用有限元方法建立了人体心脏力学模型, 并基于该仿真模型提出了一种无创推断心肌病理状态的新方案,并通过心肌梗塞定位试验加以验证。仿真研究表明这种基于模型参数优化解的方法能将心肌梗塞定位到模型基本单元的空间范围,可用于提取心肌疾病信息。     

补料优化降低抗体生产过程中宿主细胞蛋白残留的研究

目的:通过上游工艺中补料培养基优化以降低单克隆抗体生产中的宿主细胞蛋白(HCP)水平。方法:本文在3 L反应器的工艺开发过程中考察了不同的商品化补料培养基和细胞接种密度对HCP水平的影响,筛选出最优条件后,进行了补料工艺的优化和金属离子的添加试验,最后将优化后的工艺放大至200 L中试规模。结果:在小试阶段发现Cellvento 4Feed可以显著降低HCP,同时CuSO4可以进一步促进HCP降低的水平,最终将工艺放大至200 L中试进行生产并取得了相似的结果,验证了工艺的稳定性和可放大性,中试规模的HCP水平相比最初的工艺降低了65%左右。结论:补料培养基优化可以有效降低细胞对HCP的比生产速率,使收获液中整体的HCP水平显著下降。     

枯草杆菌蛋白耐热性改造区域的识别

热稳定性相关区域的识别是蛋白耐热性改造的关键问题之一。本文以枯草杆菌蛋白（SUBTILISIN BPN）为研究对象,通过枯草杆菌蛋白同源家族序列的统计耦联分析,提取枯草杆菌蛋白中的保守残基和强耦联残基,并运用分子动力学模拟方法,提取枯草杆菌蛋白表面候选突变残基,综合上述结果,提出了枯草杆菌蛋白表面耐热性改造关键区域的识别方法,并利用该方法确定了枯草杆菌蛋白表面的10个耐热性改造关键区域。将该结果与已有的耐热性突变实验资料进行了对比,发现其中的7个预测区域与实验结果吻合。结果验证了该方法可以较好地识别蛋白耐热性改造关键区域。     

响应面法优化黑水虻幼虫蛋白质提取工艺

【目的】对黑水虻Hermetia illucens幼虫蛋白质进行不同提取方法的比较,选择最优提取方法,并确定其最优工艺参数,为黑水虻幼虫蛋白提取与资源利用提供依据。【方法】以黑水虻幼虫为原料,分别采用碱提法、酶提法、盐提法和Tris-HCl缓冲液提法对黑水虻幼虫蛋白质进行提取,并比较分析。通过单因素试验分别确定NaOH质量浓度、液料比、提取温度及提取时间4个因素的较优水平。在单因素试验结果基础上,按照Box-Behnken响应面试验设计进行响应面优化试验。【结果】提取黑水虻幼虫蛋白质的4种方法中碱提法的提取率最高,最佳提取条件为：NaOH质量浓度2.44 g/100mL,液料比22 mL/g,提取温度53℃,提取时间2 h。提取率验证试验结果为88.49%,与预测值相对误差为0.28%。【结论】响应面模型拟合度高,优化出的最佳提取工艺可行。     

27-plex SNP种族推断方法的优化及验证

人类学中常将人群分为东亚黄种人、欧洲白种人和非洲黑种人。27-plex SNP种族推断体系可针对来自东亚、欧洲、非洲及欧亚混合人群的样本进行分型检测进而推断其祖先来源。本研究对该体系获取样本分型后的种族推断分析方法进行了进一步优化,建立了一种基于似然比、祖先成分和种族归类的推断分析方法,并对4个来自东亚、欧洲、非洲及其混合人群的测试样本进行种族来源推断。使用基础参考数据库交叉验证和1010份测试样本验证两种方式进行了种族推断方法流程的评估研究。验证结果表明该方法体系在东亚、欧洲、非洲及欧亚混合人群中的推断准确性均高于99%。本种族推断方法可对DNA来源人的种族信息进行刻画,在人类分子遗传学、法医遗传学等领域有重要的应用价值。