LytSR和PdtaSR双组分系统对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成的影响

【目的】须糖多孢菌(Saccharopolysporapogona)基因组中存在一些双组分系统(two-component system,TCS),包括一个LytR调控因子和一个PdtaR转录抗终止调节因子,我们旨在通过基因工程技术改造分析这两个双组分系统蛋白在须糖多孢菌中的作用。【方法】本研究利用融合PCR和属间接合转移技术,构建了S. pogona-?lytR和S. pogona-PdtaR工程菌株,研究它们对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成的影响。【结果】HPLC检测和质谱鉴定表明,与原始菌相比,S. pogona-?lytR中丁烯基多杀菌素产量有所提高,而S. pogona-PdtaR中产量下调,表明lytR和pdtaR对丁烯基多杀菌素生物合成有负调控作用。此外,生长曲线测定和表型分析结果表明,S. pogona-?lytR和S. pogona-PdtaR对须糖多孢菌的生长发育和孢子形成也产生了一定的影响。【结论】本研究为进一步阐明丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制奠定了理论基础。     

fcl基因对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成及生长发育的影响

fcl基因编码的GDP-岩藻糖合成酶(GDP fucose synthetase,GFS),能催化由GDP-D-甘露糖合成GDP-L-岩藻糖过程中的两步差向异构酶和还原酶反应;还参与氨基糖和核糖的生物合成,是调控生物体糖代谢、核苷酸代谢的关键酶之一。通过前期基因组测序表明须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona中存在fcl基因。利用基因工程技术构建了fcl基因的过表达菌株S. pogona-fcl和敲除菌株S. pogona-Δfcl。结果表明该基因对菌株生长发育、蛋白表达及其转录水平、杀虫活性、丁烯基多杀菌素的生物合成均存在影响。经HPLC分析显示,S. pogona-Δfcl的丁烯基多杀菌素产量增加为野生型菌株的130%,S.pogona-fcl的丁烯基多杀菌素产量降低了25%。生测结果显示,与野生型菌株相比S.pogona-Δfcl对棉铃虫的杀虫活性明显增强,而S.pogona-fcl的杀虫活性降低。利用扫描电镜观察发现,S. pogona-Δfcl菌丝体表面出现褶皱,呈现短棒状,S. pogona-fcl菌丝形态与野生型菌株一致。以上结果表明,fcl基因的敲除影响菌丝体的生长发育,能促进丁烯基多杀菌素的生物合成和增强杀虫活性,该基因的过表达抑制了丁烯基多杀菌素的生物合成和降低了杀虫活性。SDS-PAGE结果表明,三株菌株在96 h时蛋白表达差异最为明显。对差异蛋白通过实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,三菌株蛋白的转录水平存在显著表达差异。通过研究结果构建了网络代谢调控图,分析fcl基因对须糖多孢菌生长发育及丁烯基多杀菌素生物合成代谢调控网络途径的影响,初步构建了fcl基因调控的代谢途径,为揭示丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制及相关后续研究提供了实验依据。     

须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的核糖体工程改造对丁烯基多杀菌素合成的影响

核糖体工程是以微生物的各类抗生素抗性突变为筛选标记,高效获得次生代谢产物合成能力提高的突变株的一种育种新方法。通过核糖体工程技术,使用链霉素对须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona进行抗性选育,以获得高产丁烯基多杀菌素突变菌株。对原始菌株和所获得的突变菌株代谢产物的研究发现,相对于原始菌株,其中突变株S13的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高了1.79倍。经质谱测定表明,其代谢物中比原始菌株多了一种丁烯基多杀菌素组分Spinosynα1。对抗性突变株S13的DNA序列进行分析,发现在编码核糖体S12蛋白的rps L基因保守区域中出现点突变,第314位和第320位的胞嘧啶(C)分别突变为腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T),对应的氨基酸残基分别由脯氨酸突变为谷氨酰胺,丙氨酸突变为缬氨酸。研究显示,突变株S13遗传稳定性良好。     

金霉菌的生理和金霉素的生产 金霉菌对醣类的生物氧化和金霉素综合的研究

在研究金黴菌对醣类的氧化和金黴素的生产中,我们的工作指出磷酸盐起着一个很显著的影响。发酵培养基中磷酸盐浓度的增加,一般促进了菌体对醣类的氧化从而影响到菌体的生长和金黴素的产量,关於金黴菌对醣类的氧化代谢方面,我们初步研究的结果希望能够提供封金黴菌利用碳源进行发酵时的一点理论基础。一.菌体对醣类的利用以金黴菌 Streptomyces aureofaciens A 3菌株为试验材料,以有机发酵培养基进行试验,结果指出这个菌株能利用蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖和澱粉进行发酵,但不能利用麦芽糖、乳糖、甘露糖及山梨糖。在这几种可以被利用为碳源的醣类中,葡萄糖要算是最适合於对金黴素生产用的碳源,而澱粉是较适合於菌体生长用的碳源。但对金黴素生产上最适宜的碳源並     

深黄被孢霉利用不同碳源产油脂比较

本研究主要探讨深黄被孢霉M2菌株对生物质全糖的利用,考察其碳源同化能力、不同碳源下产脂情况以及对玉米皮渣的利用能力。研究结果表明,M2菌株能够利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖进行生长和油脂积累。M2菌株以6%糖浓度的玉米皮渣水解液为底物发酵培养,油脂微生物生物量达18.2g/L,干菌体油脂含量45.7%,单位体积发酵液油脂产量为8.3g/L。     

碳源影响水稻根际假单胞菌PA1201藤黄绿菌素的生物合成

【背景】假单胞菌PA1201是一株水稻根际促生菌,其产生的次生代谢物藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)能够有效抑制多种植物病原真菌和细菌的生长,但在常规培养条件下Plt产量极低。【目的】研究碳源对Plt生物合成的影响,为提高Plt的产量以及应用提供理论基础。【方法】将基本培养基(minimal medium,MM)中甘露醇替换为不同的碳源及碳源组合作为PA1201的培养基,生长过程中不同时间点取样提取Plt,利用高效液相色谱(HPLC)法分析Plt的产量变化。【结果】建立了基于HPLC定性和定量检测Plt的方法;比较了PA1201菌株在不同培养基中菌株生长和Plt的产量,发现果糖和甘露醇促进Plt生物合成;果糖和甘露醇对Plt生物合成没有增效作用;在含有甘露醇或果糖作为唯一碳源的培养基中,添加葡萄糖或琥珀酸抑制Plt生物合成。【结论】果糖和甘露醇促进水稻根际假单胞菌PA1201合成藤黄绿菌素,这为提高藤黄绿菌素的生物合成效率和促进藤黄绿菌素的应用奠定了基础。     

提高蛋白激发子产量的培养基及发酵条件的优化

为了进一步提高极细链格孢菌产蛋白激发子的产量,通过单因子和多因子试验与分析,筛选优化了适于极细链格孢菌产生蛋白激发子的培养基和培养条件,并检测了发酵过程中pH、还原糖、氨基氮和菌丝量变化以及与蛋白激发子产量的关系。结果表明,土豆淀粉和黄豆粉对蛋白激发子产量影响最大,其次是蛋白胨和无机盐。优化的发酵培养基主要成分（g／L）：碳源I 15、葡萄糖5、玉米淀粉5、土豆淀粉20、谷氨酸10、氮源I5、黄豆粉10、硫酸铵5。确定了优化的培养条件,调整培养基起始pH为7．0～7．5,将18h菌龄的种子培养液按10％接种量接种到装液量为75mL的500mL摇瓶中,在温度（28±1）℃、摇床转速180r／min下培养可获得理想的蛋白产量。在优化的培养基和培养条件下,发酵12～48h该菌进入对数生长期,48h进入稳定生长期,60h菌丝扣蛋白激发子产量达最高。蛋白产量与菌体生物量呈正相关,当还原糖、总糖量消耗到最低水平时,菌丝产量和蛋白激发子产量达最高。优化的培养基菌丝干重收率迭3．9g／100mL,蛋白激发子产量达到5．17g／L,比普通的土豆液体培养基提高近4倍。     

假蜜环菌液体深层发酵条件的研究

对该真菌菌丝体的液体深层培养条件进行了探讨为进一步工业化发酵提供参考数据。方法：在基本培养基的基础上分别改变碳源、氮源、无机元素和C／N比对该菌的液体深层发酵情况,包括测量各培养条件下耗糖情况、绘制生长曲线,观察菌体的生长形态等等。结果：假蜜环菌的菌丝产量在第6d可达到最大值,其后会逐渐降低,并伴有溶菌的现象发生。在培养初期加入微量钴元素有利于刺激糖代谢提高菌体对糖的利用率,其作用主要是缩短延滞期。进入指数生长期后连续补加碳源有利于菌体迅速生长。优化后培养基组成为：葡萄糖l％和蔗糖1％为碳源,以酵母浸膏l％为氮源,KH2PO4 0．1％,MgSO4 0．05％Z,元素钴适量。液体深层发酵培养6d后菌丝生长状态已达到最佳,在此条件下搅拌发酵培养可收获20mg/ml(干重)的菌丝体。     

一株厌氧嗜热杆菌生长及发酵特性的初步研究

论文对筛选并鉴定为Thermoanaerobacterium saccharolyticum菌株的生长、底物利用情况、产物生成以及酒精耐受性进行了研究。结果表明,该菌在以甘露糖、葡萄糖和木糖为碳源时生长较好,同时能够较好的利用木聚糖和木薯淀粉;最适底物浓度为15g/L;不同的葡萄糖:木糖比例对其生长无显著影响;能耐受的培养基最高初始酒精浓度为3%(V/V)。在5g/L的木聚糖、木糖和木薯淀粉培养基中发酵60h后,产物主要有乙醇、乳酸和乙酸,乙醇产量分别为0.824、0.867和0.916g/L。     

不同的底物流加方式对Alcaligenes faecalis发酵生产热凝胶的影响

目的：研究了在不同阶段、不同的底物流加方式及底物浓度对菌体生长和热凝胶合成的影响,并对粪产碱杆菌WX—C12（Alcaligenes faecalis）发酵生产热凝胶的补料工艺进行了优化。方法：15L发酵罐发酵生产热凝胶,改变培养基中氮源、碳源浓度及流加方式,测定残氮、残糖、菌体浓度及热凝胶产量的变化,确定较优的补料工艺。结果：在菌体生长阶段用氨水控制pH在7．0,可使培养基中氮源浓度维持相对稳定状态,且NH,a初始浓度较低（O．5gtL）更适合菌体生长;热凝胶合成阶段采用葡萄糖连续流加优于间歇补加培养。菌体浓度为11．9g／L时,热凝胶产量最高（72g／L）,产物得率Vp／s为78．8％;当菌体浓度再增加时,热凝胶产量反而下降。结论：确定了粪产碱杆菌发酵生产热凝胶的较优工艺条件,热凝胶产量最高为72g／L,比分批发酵28g/L增加了157％。     

竹黄菌液体发酵条件的优化

目的：筛选并优化竹黄菌液体发酵培养基。方法：采用单因子和3因素3水平正交试验法,从生物量和竹红菌素两方面筛选碳源、氮源和pH,探讨该菌生长的最佳培养条件。结果：最佳发酵碳源是葡萄糖,最佳发酵氮源是硝酸钠。竹红菌素生长的最佳配方为2%葡萄糖,0.2%硝酸钠,pH7.5;菌丝体生长的最佳组合为2%葡萄糖,0.3%硝酸钠,pH7.5。     

酵母细胞转运正烷烃的研究——Ⅱ.糖类对突变菌株U_(3-21)的生长、乳化剂和二羧酸产生的影响

以不同碳链的正烷烃作为唯一生长碳源时,U_(3-21)菌株产生乳化剂的量不同,因而菌体生长也不同,产生乳化剂多的,菌体生长也好。本文主要报道在烷烃发酵中,糖类对菌株产生乳化剂的促进与抑制怍用,0.15%的蔗糖,大大促进了乳化剂的产生,加速菌体生长,提高二羧酸的产量。发酵培养基初始pH不同,也影响菌体生长和二羧酸产量。     

高效利用木糖产油的氮离子注入Mortierella alpina诱变选育研究

木糖的有效利用是木质纤维素全利用的基础。为了获得高效利用木糖产油的高山被孢霉菌株,通过多轮氮离子束诱变,筛选出一株有效利用木糖的产油高山被孢霉1502．8（MortiereUaalpina1502—8,MAIS02．8）,并研究了以葡萄糖／木糖（W／W,5／3）组成的混合糖为碳源,突变株生长和油脂积累的特性。采用单因子和正交实验对培养基组成和发酵条件进行了优化,结果表明,诱变菌在温度28oC,pH8．0,接种量8％,装液量30％,蛋白胨0．76％和豆粕1％,分批补糖的最优发酵条件下发酵9d,生物量和菌体油脂积累量分别达29．8g／L和11．7g／L,较出发菌提高了2．59倍和2．05倍,同时原料糖利用率达到99．4％。     

深红虫草高产卵孢菌素的培养基筛选及发酵条件优化

本研究以提高深红虫草Cordyceps cardinalis C033次级代谢产物卵孢菌素的产量为目标,对其产卵孢菌素的培养基进行筛选,并利用单因素和正交试验对深红虫草产卵孢菌素的发酵条件进行了优化。结果表明,深红虫草产卵孢菌素的最适发酵培养基为马铃薯‐蛋白胨‐葡萄糖培养基,最佳发酵参数为:发酵时间6d,培养基初始p H 7.0,接种量6%,培养温度24℃,每500m L锥形瓶装液量100m L,摇瓶转速120r/min。用最佳培养基进行发酵条件优化后获得卵孢菌素448.70μg/m L,产量是优化前的10.14倍。该研究结果为菌株C033在农业害虫防治上的应用奠定了基础。     

Optimization of high cell-density fermentation of Lactobacillus casei with function of removing microcystin

为提高一株具有藻毒素清除能力的干酪乳杆菌Lactobacillus casei BBE10-212单位体积的活菌数,针对其营养需求,研究了不同碳源、氮源、缓冲盐、微量元素及生长因子对该菌株生长情况及发酵特性的影响.通过响应面法对碳源、氮源、生长因子等进行优化,获得最佳培养基配方为:α-乳糖43.8 g/L,酵母膏79.5 g/L,无水乙酸钠13.12 g/L,冰醋酸9.17 mL/L,MnSO4 ·H2O 190mg/L,吐温-80 5.15 mL/L.经37℃培养18 h,菌体干重达到4.97 g/L,比在普通MRS培养基中(1.32 g/L)提高近4倍.基于乳酸菌发酵过程中的产酸特性,通过外源添加5 g/L谷氨酸,促使菌体浓度进一步提高15％,并提前1.2h进入生长稳定期.上述研究结果为食品行业重要生产菌株干酪乳杆菌的高密度培养技术提供了可借鉴的研究思路.     

基于响应面法的高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基的研制与效果评价

【背景】禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)引发的禽霍乱疫情造成了巨大的危害,而现有培养基存在培养菌密度较低的问题。【目的】研制高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基。【方法】通过单因素试验、Plackett-Burman试验和响应面分析方法对禽多杀性巴氏杆菌培养基的成分进行调整,并对不同发酵阶段的菌体进行免疫原性测定。最后使用该培养基培养细菌后制备疫苗并通过动物攻毒试验评价其保护效果。【结果】使用研制的培养基培养禽多杀性巴氏杆菌,活菌密度能够在6 h达到约1.84×1010 CFU/mL,增菌效果是对照培养基的2.6倍;免疫原性测定结果显示在生长平台期菌体的抗原活性最高;攻毒试验表明制备的疫苗能够很好地抵抗禽多杀性巴氏杆菌的侵袭。【结论】研制出了高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基,为疫苗的生产奠定了基础。     

应用响应面法优化发酵培养基提高达托霉素产量

【背景】达托霉素来自玫瑰孢链霉菌NRRL 11379的发酵产物,是重要的临床用抗生素。其原始产生菌发酵周期长,影响达托霉素的生产效率。本实验室前期在天蓝色链霉菌中重构了达托霉素的生物合成途径,有效地缩短了发酵周期,但重组菌株K10中达托霉素发酵产量很低,制约了后续的研究和开发。【目的】利用响应面法优化产达托霉素的重组菌天蓝色链霉菌K10的发酵培养基组分,获得达托霉素高产的发酵培养基配方。【方法】采用单因素实验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面法设计优化达托霉素发酵培养基,使用Design Expert 8.0对实验数据进行分析。【结果】培养基各成分中影响达托霉素产量的3个主要因素是糊精、酵母提取物和酪蛋白,其最佳浓度分别为25.11、2.20和2.00 g/L。在此条件下,达托霉素产量达到15.30 mg/L,较原始培养基产量提高了2.17倍。【结论】实验获得了达托霉素产量明显提高的天蓝色链霉菌K10发酵培养基配方,为达托霉素的后续研究提供可靠支撑。     

Candida glycerinogenes metabolic fermentation using different carbon sources

研究了不同碳源对Candida glycerinogenes的菌体生长、发酵液pH值及代谢产物的影响,结果发现以葡萄糖、果糖等单糖为碳源时菌体生长较快,最终生物量比以蔗糖、麦芽糖等二糖为碳源时高20％～30％;导致发酵前12 h发酵液pH值明显下降的主要因素是乳酸;与葡萄糖为碳源转化为甘油相比,果糖为碳源时更易累积乙醇;以蔗糖、麦芽糖为碳源时,用于转化生成甘油的碳源明显降低,碳源主要用于菌体自身生物合成及HMP途径,以蔗糖为碳源时,用于乳酸、丙酸及柠檬酸生物合成的碳源较麦芽糖明显提高,TCA途径代谢较为活跃.     

高糖和氮源对鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)L-乳酸发酵的影响

鼠李糖乳杆菌经实验室耐高糖高酸选育,能够在高糖浓度下高效高产L-乳酸。以酵母粉为氮源和生长因子,葡萄糖初始浓度分别为120 g/L和146 g/L,摇瓶培养120h,L-乳酸产量分别为104g/L和117.5g/L,L-乳酸得率分别为86.7%和80.5%。高葡萄糖浓度对菌的生长和乳酸发酵有一定的抑制。增加接种量,在高糖浓度发酵条件下,可以缩短发酵时间,但对增加乳酸产量效果不明显。乳酸浓度对鼠李糖乳杆菌生长和产酸有显著的影响。初始乳酸浓度到达70g/L以上时,鼠李糖乳杆菌基本不生长和产酸,葡萄糖消耗也被抑制。酵母粉是鼠李糖乳杆菌的优良氮源,使用其它被测试的氮源菌体生长和产酸都有一定程度的下降。用廉价的黄豆粉并补充微量维生素液,替代培养基中的酵母粉,可以使产酸浓度和碳源得率得以基本维持。     

食用真菌蛋白——美味丝葚霉D-100的研究——Ⅲ.丝状真菌连续发酵的研究

本文研究了以丝状真菌D-100直接利用淀粉连续发酵的工艺条件。通过氮源试验,摇瓶生长曲线和发酵罐生长曲线的对比试验,发酵过程中淀粉糖化酶的定量检测,以及连续发酵过程中四个主要参数在三水平上的正交试验,确定了以0.1—0.2%NH_4NO_3为氮源,0.5%玉米粉为碳源,稀释速率D值为0.15,搅拌转速为200 r/min,pH 5.5的条件为最佳连续发酵条件。连续发酵结果是:以玉米淀粉为底物的菌体产率是37.5%,其菌体蛋白质含量38.5%,发酵罐效率是0.35g菌体干重/L·h,试验还证明该菌淀粉糖化酶的生成受还原糖的反馈控制,故发酵过程培养基中还原糖浓度衡定在一定值。培养基浓度增加时,超过玉米粉浓度1.25%以上其比生长速率不明显增加。