寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

本研究旨在建立寨卡病毒(ZIKV virus,ZIKV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)以及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)三种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术。选用ZIKV的NS1基因、DENV的NS5蛋白基因以及CHIKV的E1蛋白基因作为靶标区域设计三组特异性引物探针,建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用ZIKV、DENV、CHIKV病毒体外转录RNA和病毒细胞培养物对该方法的灵敏性、特异性、重复性等方面进行评价,最后临床样本以及模拟标本验证。结果显示:三重实时荧光定量RT-PCR检测方法扩增效率均可达到90%以上,三种病毒体外转录RNA最低检测限均低于15拷贝/PCR,病毒培养物最低检出限均低于10PFU/mL且与单重检测方法无明显差异。与其他病毒无交叉反应,变异系数均在2%以内。临床标本及模拟标本检出率均可达95%以上。本研究建立的检测寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯雅病毒的三重实时荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于寨卡病毒病等相关临床标本的检测。     

乙脑/寨卡嵌合病毒包膜蛋白T120A位点突变对小鼠脑内神经毒力的影响

为探索包膜蛋白T120A突变对乙脑/寨卡嵌合病毒JEV/ZIKV小鼠脑内神经毒力的影响,应用重叠延伸PCR和分子克隆技术构建含T120A突变的乙脑/寨卡嵌合病毒全长cDNA质粒,经酶切、测序鉴定后,以其为模板体外转录制备RNA,电转染导入BHK21细胞,收获培养液上清获得突变病毒株JEV/ZIKV (T120A)。分别用JEV/ZIKV和JEV/ZIKV (T120A)感染BHK21细胞,绘制病毒增殖曲线,比较蚀斑大小;脑内接种昆明鼠,比较病毒小鼠脑内神经毒力差异。突变病毒感染性克隆经酶切鉴定表明成功构建,增殖曲线发现:突变病毒高峰滴度为5.59 log_(10)pfu/mL,低于JEV/ZIKV的峰值(6.8 log_(10)pfu/mL),JEV/ZIKV (T120A)的小鼠脑内神经毒力LD_(50)为1.38 PFU(0.03 mL),JEV/ZIKV病毒LD_(50)为2.21 PFU(0.03 mL)。研究表明寨卡病毒包膜蛋白T120A突变降低了乙脑/寨卡嵌合病毒的复制能力,但却轻微增强了病毒小鼠脑内神经毒力。     

寨卡病毒蛋白酶结构研究最新进展

寨卡病毒在南美洲的突然爆发引起了公共健康威胁。然而目前并无针对性的疫苗和抗病毒药物防治寨卡病毒感染。寨卡病毒蛋白酶NS2B-NS3是病毒复制所需的核心酶,是最好的潜在药物靶点。针对其结构和功能研究,对深入了解病毒的复制和研发抗感染药物十分重要。本研究介绍了近期寨卡病毒蛋白酶结构研究的进展。     

寨卡病毒NS2B蛋白的表达纯化及单克隆抗体制备

目的:应用大肠杆菌重组表达并纯化寨卡病毒NS2B蛋白,制备抗NS2B蛋白的单克隆抗体。方法:构建携带NS2B基因的重组原核表达质粒,采用大肠杆菌ER2566作为表达菌株,以IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化获得NS2B目的蛋白。用纯化后的NS2B蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选制备抗NS2B蛋白的单克隆抗体,并初步分析抗体的反应活性和特异性。结果:表达并纯化获得寨卡病毒NS2B蛋白,筛选获得可与NS2B蛋白结合并具有较好反应活性的单克隆抗体2H11,该单抗可识别寨卡病毒感染细胞后表达的NS2B蛋白。结论:筛选获得靶向寨卡病毒NS2B蛋白的单克隆抗体,可为后期深入开展寨卡病毒NS2B蛋白的功能和相关抗病毒药物研究提供支持。     

表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。     

寨卡病毒非结构蛋白研究进展

自2015年巴西确诊首个寨卡病毒感染病例以来,该病毒在全球范围内迅速蔓延,引发了大规模疫情。寨卡病毒感染不仅会导致新生儿小头畸形,还会引起格林-巴利综合征,后者是一种严重的神经系统疾病,可以导致患者瘫痪乃至死亡。但是目前并没有特异性的疫苗或药物可以用于阻断寨卡病毒的感染。近几年来,寨卡病毒在复制传播过程中多个关键蛋白的结构逐步得到解析,在一定程度上为其致病机制的阐释提供了理论基础,并对特异性药物设计具有一定指导意义。主要对寨卡病毒多个非结构蛋白的三维空间结构研究进展及其抑制剂研发的主要方向进行了综述,以期为药物靶点的分析筛选及抗病毒药物的开发设计提供参考。     

人肠道病毒复制子的研究进展

人肠道病毒(human enteroviruses,HEVs)感染人类并造成严重的健康问题。目前缺乏针对HEVs的特异性抗病毒药物,且预防HEVs感染的疫苗的种类有限。HEVs的基因组结构简单且保守,故基于病毒基因组结构的病毒复制子已成为研究HEVs的重要工具,可用于病毒的分子生物学特性、病毒与宿主的关系及抗病毒药物的筛选及疫苗的研发等方面。现就HEVs复制子的研究进展作一综述。     

寨卡病毒感染者血液、尿液和唾液中IgA抗体水平初步研究

为研究寨卡病毒(ZIKV)感染者血清、尿液和唾液样本中特异性IgA抗体水平,进一步了解ZIKV感染免疫机制,本研究重组表达制备寨卡病毒NS1蛋白,对其浓度、纯度进行鉴定,初步评估了NS1蛋白抗原性,并建立间接酶联免疫(Indirect-ELISA)方法,检测患者临床血清、尿液和唾液样本中的寨卡特异性IgA抗体。利用健康人群血清、尿液和唾液标本,评估检测方法的特异性,并确定以阴性对照的均值加3倍标准差作为判定检测结果的阈值,特异性为100%。对经病毒核酸检测所确诊病例的33份血清样本、4份尿液样本和3份唾液样本进行检测。选择3份具有较高IgA抗体水平的血清,通过2倍系列稀释的方法评价了血清样本中特异性IgA抗体的滴度,可有效检出经3 200倍以上稀释的血清样本中的IgA抗体。重复性检测实验显示板间变异系数为(3.0±0.8)%,板内变异系数为(2.7±1.0)%。寨卡患者血清、尿液和唾液样本中的特异性IgA抗体的检出率分别为75.8%(25/33)、100%(4/4)和33.3%(1/3),提示IgA抗体在3种体液标本中均具有显著的存在,具有充当体外诊断指标的意义。同时尿液、唾液标本中特异性IgA抗体的存在,提示潜在的粘膜免疫效应,有助于增强对病毒体内播散和体外传播的理解,也初步提示了寨卡病毒NS1蛋白可用于相关免疫学诊断试剂的研发。     

寨卡病毒NS1的结构研究进展及其应用

寨卡病毒感染与小头畸形和神经系统并发症紧密相关,甚至可能损伤男性生殖系统,引起了全球性的关注,研究其结构和致病机制以及开发有效的诊断治疗方法成为当务之急。寨卡病毒的非结构蛋白NS1是病毒与宿主相互作用的重要蛋白,在病毒复制、发病机制及免疫逃逸中起着关键作用。本文总结了寨卡病毒NS1的空间精细结构,并将其与其它黄病毒NS1进行比较。本文也分析了寨卡病毒基于NS1的致病机理,总结了NS1在疾病诊断中的应用。     

寨卡病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的初步建立

初步建立了寨卡病毒(Zika virus)IgG抗体的间接ELISA检测方法,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据。选取寨卡病毒四种抗原,即E蛋白胞外区(Ectodomain)、NS1蛋白、C蛋白和rEⅢ蛋白进行重组表达和纯化,分别包被ELISA板并用间接法检测寨卡病人临床血清和正常人血清,确定每种检测抗原的检测敏感度和特异度。重组表达并纯化的四种寨卡病毒抗原浓度和纯度均达到检测要求。间接ELISA检测结果显示E蛋白胞外区和NS1蛋白的检测敏感度和特异度均达到较高水平,但C蛋白和rEⅢ蛋白的检测敏感度很低,不适合作为寨卡病毒的检测抗原。本研究初步评价了寨卡病毒四种抗原检测相应IgG抗体的敏感度和特异度,为研制血清学诊断试剂奠定了基础。     

寨卡病毒研究进展

寨卡病毒(zikavirus,ZIKV)发现距今已有70多年。早期的患者临床症状较轻,通常为自限性疾病。近年来,由于基因突变使ZIKV致病力逐渐增强,导致严重的神经系统并发症,引起了人们普遍关注。目前,全球尚无针对性的疫苗和药物,ZIKV的暴发、流行已经成为全球公共卫生问题。为了有效防控ZIKV感染,许多国家和地区加快了对ZIKV的研究,并取得了一定的成果,现就ZIKV的生物学特征、流行特点、致病机制及防控措施等作一概述。     

寨卡病毒蛋白结构与功能研究进展

2015年以来,南美暴发大规模寨卡疫情,因其与新生儿小头症等严重神经发育疾病密切相关,被世界卫生组织列为国际关注的突发公共卫生事件。与其他虫媒黄病毒类似,寨卡病毒为单股正链RNA病毒,其基因组编码的3种结构蛋白构成病毒颗粒,7种非结构蛋白参与病毒复制生活周期的调控。在全球科学家的共同努力下,寨卡病毒蛋白结构与功能的研究取得了突破性进展,极大地促进研究者对病毒复制与致病机制的认识,也为疫苗和药物研发提供了重要科学依据和潜在靶标。本文将对寨卡病毒蛋白的结构与功能的最新研究进展作一综述,并讨论当前面临的挑战和机遇。     

圣路易斯脑炎病毒NS2B-NS3蛋白酶的原核表达及其抑制剂的筛选

【目的】圣路易斯脑炎病毒(St. Louis encephalitis virus,SLEV)属于黄病毒科,是一种单股正链RNA病毒。黄病毒编码的非结构蛋白NS3在病毒复制以及多聚蛋白加工过程中起着重要作用,NS2B是其发挥作用的重要辅助因子。因此,NS2B-NS3蛋白酶复合物是抗病毒药物的重要靶标。本研究旨在构建SLEV NS2B-NS3蛋白酶的原核表达系统并建立其抑制剂的高通量筛选方法,从而发现其小分子抑制剂。【方法】通过PCR扩增SLEVNS2B-NS3蛋白的编码区,构建原核表达质粒;在大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside)诱导得到可溶性的NS2B-NS3蛋白,并用镍亲和层析方法进行纯化;基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer)技术检测NS2B-NS3蛋白酶活性,建立其抑制剂的高通量筛选平台。【结果】SLEV NS2B-NS3蛋白酶纯化程度高达95%以上,基于酶活测定的抑制剂筛选平台准确可行。对700多个上市药物进行筛选后,发现原花青素对SLEVNS2B-NS3蛋白酶具有明显的抑制活性。【结论】本研究为SLEVNS2B-NS3蛋白酶抑制剂提供了一种操作方便、高通量的筛选方法,并首次发现了原花青素具有抑制SLEV NS2B-NS3蛋白酶活性的功能,可以作为治疗SLEV感染的潜在靶向药物。     

寨卡疫苗相关研究进展

寨卡病毒(zika virus, ZIKV)是一种主要以蚊虫传播的虫媒病毒,其感染孕妇后,可导致胎儿畸形和新生儿小头症;感染成人后,可引起以神经缺陷为特征的自身免疫性疾病"格林-巴利综合征"等病症。近年来,寨卡病毒已是一种严重危害人类健康的病原体,对全球公共卫生产生了重大威胁,因此,各国相关研究人员均在积极研制安全有效的ZIKV疫苗,以预防该病毒的感染和蔓延。现就ZIKV的基本特征、目前正在研究的几种ZIKV候选疫苗,如减毒活疫苗及嵌合活疫苗、全灭活病毒疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗等作一概述,旨在为该疫苗的进一步研究提供参考。     

寨卡病毒新型疫苗的研究进展

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)感染可造成胎儿小头症及成人格林巴利综合症,世界卫生组织已将其定为世界公众健康紧急事件。因此急需要发展新型Zika疫苗。本文简要介绍寨卡病毒生物学性状、流行病学、临床表现,并重点对寨卡病毒3种新型疫苗(DNA、病毒载体、mRNA疫苗)研究进展进行综述与应用展望。     

寨卡病毒RNA恒温快速扩增检测方法的建立

2015年以来,寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)感染被报告和小头症之间存有关联,已有多个国家和地区报告ZIKV感染证据,我国持续面对ZIKV输入风险。为发展适用于现场的快速高效的ZIKV核酸检测方法,选取ZIKV NS1片段保守区设计特异性引物探针,经优化建立了多种功能蛋白介导的ZIKV RNA恒温快速扩增检测方法。利用所制备的ZIKV NS1片段体外转录RNA作为参考品,并与实时荧光定量RT-PCR检测结果进行比较。同时利用ZIKV细胞培养物中加入健康人血清制备的模拟临床标本进行初步验证。结果显示,建立的RNA恒温快速扩增检测方法可100%检出100拷贝/μL体外转录RNA,可在15 min以内判读,大大低于PCR的常规检测时间;用该方法检测其他相关病毒,无交叉反应。病毒滴度在(10~4～10~7PFU/mL)之间的模拟临床病人标本可达到100%检出。本研究建立的ZIKV RNA恒温扩增快速检测方法快速、灵敏、特异,适用于ZIKV现场应急检测,为ZIKV的防控提供了重要的技术支撑。     

黄病毒NS2B-NS3pro蛋白酶的结构研究进展

黄病毒能引起严重的人类疾病,但是并无特定药物来治疗病毒感染。黄病毒非结构蛋白NS3的N端区域及其辅因子NS2B构成蛋白酶,该酶切割病毒的多聚蛋白形成成熟的结构蛋白和非结构蛋白来帮助病毒完成增殖过程。NS2B-NS3pro蛋白酶在黄病毒生命周期中起关键的作用,使之成为抗病毒药物研发的重要靶标。本文综述了黄病毒属中寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗病毒的NS2B-NS3pro蛋白酶结构的研究进展,并介绍了相关抑制剂与蛋白酶形成的复合物结构,以期为研发抗黄病毒药物提供必要的参考。     

人肠道病毒D68型微复制子的建立

建立人肠道病毒D68型(EV-D68)微复制子体系。利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)或萤火虫荧光素酶(FLuc)报告基因替换病毒编码区,通过酶切连接,构建EV-D68 T7和PolⅠ系统微复制子体系,获得重组质粒pT7-miniEGFP、pT7-miniFLuc、pHH21-miniEGFP、pHH21-miniFLuc和pHH21-miniFLuc_(ΔpolyC)。微复制子转染RD细胞,48h后荧光显微镜观察EGFP表达情况或用双报告系统检测荧光素酶表达水平。T7和PolⅠ系统微复制子均可表达报告基因,但PolⅠ系统荧光素酶表达水平是T7系统的5倍。并且病毒非编码区的PolyC区域对于病毒蛋白的表达起着重要的作用。本研究成功构建了EV-D68微复制子体系,为EV-D68非编码区功能研究提供工具。     

乙脑/寨卡嵌合病毒包膜蛋白V343A及I341V/V343A联合突变对小鼠脑内神经毒力的影响

为探讨乙脑/寨卡嵌合病毒JE/ZIKV(MR766)的包膜蛋白V343A突变及I341V/V343A联合突变对小鼠神经毒力的影响，分别构建了V343A和I341V/V343A联合突变的嵌合病毒全长cDNA质粒，经酶切鉴定后，体外转录获得病毒RNA，并电转染入BHK21细胞拯救病毒。利用病毒测序和免疫荧光实验鉴定病毒；蚀斑实验和生长曲线对比突变病毒与亲本株生物学特性差异；动物实验比较神经毒力差异。基因测序与免疫荧光等证明突变病毒JE/ZIKV(V343A)和JE/ZIKV(I341V/V343A)拯救成功。突变病毒JE/ZIKV(V343A)和JE/ZIKV(I341V/V343A)的蚀斑直径分别为（1.09±0.15） mm和（1.15±0.29） mm，小于亲本株JE/ZIKV(MR766)蚀斑直径（2.09±0.36） mm（P<0.001）；生长曲线显示两突变病毒增殖速度均快于亲本株，且JE/ZIKV(I341V/V343A)快于JE/ZIKV(V343A)；动物实验结果显示，JE/ZIKV(V343A)的LD50为5.62 pfu/0.03 mL，JE/ZIKV(I341V/V343A)的LD50为34.84 pfu/0.03 mL，均高于亲本株（LD50=2.21 pfu/0.03 mL）。研究结果表明，寨卡病毒E蛋白V343A突变使嵌合病毒小鼠脑内神经毒力减弱，I341V/V343A联合突变使病毒毒力进一步减弱，表明E蛋白的341和343位氨基酸残基参与了嵌合病毒对小鼠的脑内神经毒力的调控。