脐带血来源间充质干细胞体外分离培养条件的优化

脐带血间充质干细胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs）不仅可以作为滋养层细胞支持造血干细胞在体外的大规模扩增,在造血移植过程中还能够降低并发症的发生率以及加速造血重建功能的恢复．但是,目前UCB-MSCs的原代分离培养成功率一般只有30％左右,为进一步提高该成功率,利用正交实验方法对UCB-MSCs体外培养的主要影响因素：细胞的接种密度、细胞因子的组合及用量、是否添加血清和滋养层细胞,进行逐层筛选,并对培养出的间充质干细胞进行了流式细胞分析和向成骨、软骨及脂肪方向的诱导分化检测,以期获得UCB-MSCs培养的最佳方法．实验结果表明,细胞的接种密度是UCB-MSCs培养最显著的影响因素（P〈0．1）,接种密度越大,MSCs越容易生长,能够培养出MSCs的几率就越大,其次为细胞因子,添加细胞因子能有效地刺激MSCs的生长．在高接种密度的基础上,添加细胞因子IL-3（15μg／L）和GM-CSF（5μg/L）,可大大提高UCB-MSCs体外原代培养的成功率,从30％左右提高到90％以上．流式细胞检测结果显示,所分离培养的细胞表达间充质干细胞的抗原（CD13^＋、CD29^＋、CD44^＋、CD105^＋、CD166^＋）,不表达造血细胞的抗原（CD34^-、CD45^-、HLA-DR^-）,并能够向成骨、软骨及脂肪方向分化,这与源于骨髓的间充质干细胞相一致．所建立的培养方法能够为UCB-MSCs的临床应用提供大量优质的种子细胞．     

冻结速率对血小板冷冻干燥保存的影响

冷冻干燥法是使血小板能够长期保存的一种理想方法。冻结过程对血小板的冻干保存至关重要。采用梯度降温、搁板预冷、液氮冻结等三种冻结方式,研究了冻结速率对血小板冷冻干燥保存恢复率的影响。实验结果表明用搁板预冷的方式冻结并干燥的血小板复水后的恢复率最高,达到(93.0.2)%,此时的冻结速度约为10℃/min。扫描电镜照片显示冻干复水后的血小板保持了完整的细胞结构,但与新鲜血小板相比略呈球形。冻干复水后的血小板对1U/ml凝血酶的最大聚集率接近于新鲜血小板,但聚集速度比新鲜血小板慢。     

S-亚硝基谷胱甘肽诱导脐带血CD34+细胞来源的巨核细胞产生血小板

为了探讨一氧化氮供体S-亚硝基谷胱甘肽（S—nitrosoglutathione,GSNO）对脐带血CD34^＋细胞分化来源的巨三核细胞产生血小板的可能作用,我们采用免疫磁珠法从8例健康产妇足月顺产的胎儿脐带血中分选CD34^＋细胞,并在含血小板生成素（thrombopoietin,TPO,50ng／ml）、白细胞介素-3（IL-3,10ng／ml）、干细胞因子（stem cell factor,SCF,50ng／ml）和重组人粒-巨噬细胞刺激因子（rHu GM—CSF,20ng／ml）的无血清培养基中培养14d。随后,用免疫磁珠法分选CD61^＋细胞。CD61^＋细胞在含有（实验组）和缺乏（对照组）GSNO（20mg／ml）的无血清培养基[含TPO（50ng／ml）、IL-3（10ng／ml）、SCF（50ng／ml）]中培养不同时间（30min、2h）。采用流式细胞仪检测培养体系中的血小板数;电子显微镜观察巨核细胞的形态学;倒置显微镜和流式细胞仪观察凝血酶诱导的血小板凝集;ELISA方法检测巨核细胞中cGMP的含量。结果显示,与对照组比较,实验组血小板数量明显增加（P〈0．05）;电子显微镜下可见巨核细胞有明显伪足形成和突出;凝血酶诱导后在倒置显微镜和流式细胞仪上均可观察到血小板凝集现象;GSNO作用后巨核细胞中的cGMP明显升高（P〈0．05）。这些结果提示,GSNO可以促进脐带血CD34^＋细胞来源的巨核细胞产生具有一定功能的血小板,其产生的机制可能部分与cGMP途径有关。     

GST-hDSL重组蛋白的原核表达纯化及对人造血祖细胞的扩增作用

目的:原核表达DSL与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白并研究观察GST-hDSL对人脐带血CD34 造血祖细胞的体外扩增作用.方法:将人DSL cDNA的蛋白编码序列克隆入原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌DH5α中诱导表达融合蛋白,用DEAE阴离子交换柱纯化目的蛋白.然后分离、纯化脐带血CD34 造血祖细胞,不加细胞因子或加入SCF(干细胞生长因子,stem cell factor)和GM-CSF(粒-巨噬细胞集落刺激因子,granuloeyte-macrophage colony-stimulating factor),经过14天的培养,检测GST-hDSL对细胞总数、CD34 细胞百分率、以及集落形成的影响.结果:当SCF和GM-CSF存在时,GST-hDSL组的CD34 细胞百分率,集落(colony forming cells,CFC)数以及高增值潜能集落(high proliferative potential colony forming cells,HPP-CFC)数分别是时照组的1.9、1.2、5.3倍.结论:当与SCF和GM-CSF联合作用时,重组GST-hDSL蛋白对造血祖细胞具有扩增作用.     

小鼠胚胎干细胞定向血管内皮和造血细胞分化体系的建立

目的:建立小鼠胚胎干细胞体外定向分化为血管内皮细胞和造血细胞的体系,并验证诱导后2种细胞的表面分子特征。方法:以小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,首先在无血清培养基StemPro中加入骨形态发生蛋白4(BMP4)、激活素A、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-Basic)和血管内皮细胞生长因子(VEGF),诱导小鼠胚胎干细胞系R1/E 4 d后形成拟胚体;再将拟胚体消化后与OP9-DL1基质细胞共孵育,分别用干细胞因子(SCF)、VEGF和SCF、FLt3、白细胞介素3(IL-3)诱导向内皮和造血2个方向分化,并以CD31、CD45、CD144、Kit、CD201作为表面标志,流式检测诱导后细胞的表面分子特征和诱导效率;诱导10 d后免疫组化染色,进行内皮细胞的形态学鉴定。结果:诱导分化10 d后,免疫组化染色观察到多个内皮管状结构,流式检测CD31^+的内皮细胞比例为1.35%±0.05%,进一步分析CD31^+CD144^+CD45^-群体,有3.0%±0.2%的细胞表型为Kit^+CD201^+,提示该部分细胞可能是处于分化上游的内皮干祖细胞;CD45^+的造血细胞比例为35.0%±0.5%,其中0.35%±0.05%的细胞表达Kit和CD201,提示该部分细胞可能是处于分化上游的造血干祖细胞。结论:本研究将胚胎干细胞诱导为内皮细胞和造血细胞,并且能诱导出具有内皮、造血干祖细胞分子特征的细胞,可作为理想的体外诱导分化体系。     

人脐带血间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的:探讨并建立稳定可靠的人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)体外分离和培养方法.方法:采用密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞,利用MSC易黏附塑料贴壁生长的特性,分离MSC并进行体外扩增培养,观测其形态学特征,绘制不同代数hUCBMSC生长曲线,流式细胞技术检测细胞表面标志物CD29、CD34、CD105、HLA-DR等表达情况.结果:本法可成功、可靠地在体外自hUCB中分离培养出粘附细胞,该细胞在体外培养呈梭形或成纤维样,其指数生长倍增时问约为36h,其细胞表面表达β1整联蛋白CD29、CD105(endoglm),不表达造血细胞标志物CD34以及HLA-DR.结论:人脐带血中存在问充质干细胞,采用优化的实验方法可以提高培养成功率,稳定获得MSC并体外扩增培养.人脐带血可以作为获得间充质干细胞稳定充足的来源.     

脐带间充质干细胞——组织工程的新视角

目的 从脐带中分离培养脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC) 并进行鉴定,阐明其多向分化的潜在作用.方法 收集健康胎儿脐带,分离培养脐带中的间充质干细胞,以流式细胞仪对培养的间充质干细胞进行细胞表面标志检测,多种成分联合诱导其向脂肪、成骨方向分化,细胞化学染色检测诱导后的细胞变化.结果 脐带中分离培养的间充质干细胞不表达造血细胞系的标志CD34、CD45、HLA-DR,强表达CD105、CD44、CD90,在适当的诱导条件下可向脂肪及成骨方向分化.结论 脐带中存在具有多向分化潜能的间充质干细胞.     

人胎盘间充质干细胞对脐血CD34~+细胞迁移作用的影响

人胎盘作为间充质干细胞的新来源在调控造血干/祖细胞(CD34+细胞)发育与分化方面具有重要作用,但其在移植中是否对CD34+细胞迁移起作用尚不清楚.为此,本研究通过胰酶消化法和密度梯度离心法,单克隆筛选培养出人胎盘来源间充质干细胞,RT-PCR检测其与造血和趋化相关的细胞因子和黏附分子的表达;进一步利用transwell体系检测其对脐血CD34+细胞的迁移作用.结果表明,PDMSCs呈现典型的成纤维样细胞,表达间充质干细胞相关表面抗原CD73,CD90和CD105,不表达造血及内皮细胞表面抗原CD34,CD45,CD31等,PDMSCs具有诱导成脂肪、成骨和成软骨的能力.RT-PCR检测结果显示,PDMSCs表达IL-6,LIF,G-CSF,GM-CSF,M-CSF,FL,SCF,SDF-1,VEGF等多种造血与趋化因子,Integrinβ1,Integrinα5,ICAM-1,ICAM-2,ICAM-3,VCAM-1等多种黏附分子;将PDMSCs按照不同密度接种在transwell体系,4h后脐血CD34+细胞迁移率随着PDMSCs的密度增加而增加;在PDMSCs与SDF-1对CD34+细胞的趋化迁移比较实...     

外周血造血干细胞不同保存方法的比较

目的为造血干细胞低温保存选择合适的方法.方法20例外周血单个核细胞加入DMSP或DMSO加HES,-80℃冰箱(简称冰箱)或程控降温,冰箱或液氮保存,定期检测标本的CFU-GM,LTC-CD34 ,TBR,计回收率.结果冰箱降温并保存,5%DMSO-6%HES为保护剂的CFU-GM、LTC-IC、CD34 、TBR回收率分别为82.2%±14.7%、83.0%±12.2%、94.2%±4.3%、97.7%±3.9%,比10%DMSO者具体回收率明显高(P＜0.05);同一种保护剂下冰箱降温并保存与程序降温冰箱保存比,差异不显著(P＞0.05),冰箱降温并保存、冰箱降温液氮保存及程控降温液氮保存,在一年内,各种回收率差异不显著(P＞0.05),二年时,只有冰箱降温并保存者其各种回收率指标明显下降(P＜0.05);细胞复温后,标本不稀释也不洗涤,室温下放置,细胞活力的各指标均下降(P＜0.05),以含10%DMSO为保护剂者影响最大.结论造血干细胞优选保存方法是保护剂用5%DMSO-6%HES,保存时间不超过一年时,用冰箱降温并保存,长期保存时,冰箱降温则需液氮保存,细胞复温后,标本内保护剂应立即稀释(临床应用)或去除.     

β-ME和BHA体外诱导入胎肝CD34^＋细胞向神经组织细胞分化研究

目的：建立巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)和丁羟回醚(butylated hydroxyanisole,BHA)体外诱导入胎肝(fetal liver,FL)干细胞向神经细胞分化模型。方法：采用MACS试剂盒分离人胚胎肝CD34^ 细胞,以DMEM 10％胎牛血清培养液培养;第五代细胞待细胞融合达80％后,用DMEM 10％胎牛血清 1mmol／Lβ-ME 0．2mmol／L BHA诱导24h,PBS洗涤。然后在无血清培养基中培养5h～5d。用免疫细胞化学方法分析诱导前后的细胞表型特点。结果：经β-ME BHA诱导处理后,细胞表现神经元样细胞形态,表达神经组织细胞特异蛋白,如neustin、NeuN、NF-M、TuJ-1和NSE。统计显示81％细胞NeuN染色阳性,75％细胞TuJ-1染色阳性,47％染色NF-M阳性,90％染色NSE阳性。结论：β-ME和BHA能够诱导体外培养的人FL CD34^ 细胞分化为具有神经细胞特异性抗原和成分的神经样细胞;胚胎肝细胞具有向神经组织分化的潜能。     

沙门菌CWDMs乳酸脱氢酶同功酶的观察

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的ＣＷＤＭｓ及其宁代细菌型和伤寒杆菌粗糙型的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）同功酶,以了解沙门菌ＣＷＤＭｓ生物氧化的特点和机制,探讨ＣＷＤＭｓ变异的性质。结果表明,伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的细菌型及伤寒杆粗糙型在聚丙烯酰胺凝胶电泳后显示出相同的４种具有不同泳动速率的ＬＤＨ同功酶,但ＣＷＤＭｓ仅显示２种ＬＤＨ。ＣＷＤＭｓ的２种ＬＤＨ同功酶与其亲代细菌型及伤寒杆     

沙门菌CWDMs脂代谢检测

采用毛地黄皂苷敏感试验和菌细胞胆固醇、甘油三脂及胆碱酯酶定性与定量分析法,检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌经L 型变异后形成的细胞壁缺陷突变株(CW DM )的脂类代谢活性,了解这些CW DM 变异的性质和探讨细菌细胞壁缺陷突变与细菌演变的关系。结果表明,沙门菌CW DM s 具有显著的胆固醇和甘油三脂代谢活性、对毛地黄皂苷高度敏感并且还具有与白色念珠菌相似的胆固醇和甘油三脂的含量,但未能检出胆碱酯酶活性。CW DM s返祖菌丧失了脂类代谢酶类和胞浆膜不含胆固醇,恢复了与其亲代细菌型相似的代谢特征。提示在沙门菌天然即存在有与脂类及胆固醇代谢相关的基因,细胞壁的缺陷导致这些脂类及胆固醇代谢基因活化,以致 CW DM s 能够表达固醇和甘油三脂代谢活性和胞浆膜含有胆固醇     

沙门菌CWDMs氨基酸代谢的检测

采用氨基氨利用生长试验和谷丙转氨酶（ＧＰＴ）、谷草转酶（ＧＯＴ）、乳酸脱氨酶（ＬＤＨ）、肌酸激酶（ＣＫ）、α－闳丁酸脱氢酶（α－ＨＢＤ）、γ－谷志肽酶（γ－ＧＴ）,酸性磷酸酶（ＡＣＰ）定性与定量分析法,检测伤ＣＷＤＭｓ变异的特点及其机制,探讨ＣＷＤＭｓ变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。结果表明,沙门菌ＣＷＤＭｓ变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。结果表明,沙门菌ＣＷＤＭｓ在仅含蛋氨酸或脯氨     

光照对蕨类植物配子体假根向重力性的影响

对８种蕨类植物配子体假根向重力性反应的研究结果表明,除卷柏Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｔａｍａｒｉｓｃｉｎａ Ｓｐｒｉｎｇ配子体假根无向重力性反应并且其生长方向与光照方向无关外,其它７种的配子体假根均有向重力性反应,并且假根的向重力性反应在配子体发育初期,因光照的方向不同而异,表现为负向光性。随着配子体发育至片状体阶段,光对其向重力性反应的影响逐渐减弱,而重力的影响增强。在蕨类植物配子体发育初期,光对     

中国鳐类脑颅的研究

作者解剖观察了33种,隶于4目、7亚目、15科、19属的中国鳐类脑颅的形态。研究结果认为:锯鳐目和鳐目是原始类群,它们均具吻软骨,其中圆犂头鳐科和团扇鳐科是特化类群。电鳐目亦具吻软骨,它们是特化和退化类群。在较高等的鲼目则无吻软骨。依据鳐类不同的分类阶元,其脑颅亦各具有不同的式型。     

两种蚤的幼虫形态

关于蚤类幼虫形态的研究,进展比较缓慢,我国王敦清1956年首次描述7种蚤的幼虫形态以后,由柳支英,虞以新(1957),孙昌秀(1965),叶瑞玉(1982,1986),费荣中(1986)等学者先后共描述过约29种蚤的幼虫形态。到目前为止,我国已知蚤类幼虫形态约36种,隶属6科19属。本文描述未见报道的无棘鬃额蚤Frontopsylla aspiniformis Liu etWu(1960)和青海双蚤Amphipsylla qinghaiensis Ren et Ji(1979)两种蚤山幼虫形态。