蛇足石杉中产石杉碱甲内生真菌的分离和鉴定

【目的】从野生蛇足石杉(Huperzia serrata)中分离筛选产石杉碱甲的内生真菌。【方法】采用薄层层析及高效液相色谱法对内生真菌代谢产物进行测定和分析以期分离获得产石杉碱甲菌株,运用形态及ITS序列分析方法对产石杉碱甲菌株进行鉴定,并利用连续传代方法考察菌株遗传稳定性。【结果】经筛选获得一株产石杉碱甲内生真菌NSH-5,经形态学鉴定及ITS序列分析鉴定为轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides),其石杉碱甲产量为11.76 mg/100 m L,菌株经20次连续传代后遗传稳定。【结论】NSH-5菌株为一株具有产石杉碱甲能力的轮枝镰孢菌,该菌株的发现为生物合成石杉碱甲提供了新的菌种资源。     

中国南海硇洲岛潮间带产胞外蛋白酶的可培养海洋真菌多样性

【目的】研究中国南海硇洲岛潮间带产胞外蛋白酶的可培养海洋真菌多样性。【方法】从中国南海硇洲岛潮间带采集海水和沉积物样品,采用分离培养、蛋白酶生产菌平板检测法和基于内转录间隔区1-5.8S rRNA基因内转录间隔区2(ITS1-5.8S-ITS2)序列的系统进化分析法,研究产胞外蛋白酶真菌的多样性。【结果】采用50%海水配制的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养板从所采集的样品中分离、纯化并收集了198株真菌分离株,并采用ITS1-5.8S-ITS2序列PCR扩增、测序、BLAST和系统进化分析的方法成功鉴定了其中的178株。其中,有10株的ITS1-5.8S-ITS2序列与其在NCBI数据库中最匹配的ITS1-5.8S-ITS2序列的一致性<97,表明它们有可能是新的物种;其余168株的ITS1-5.8S-ITS2序列与NCBI数据库中已存在的相关ITS1-5.8S-ITS2序列的一致性均≥98%。这178株真菌归属为66个种,分布在子囊菌门和担子菌门的6纲,16个目,27个科的45个属中。其中的主要属为青霉菌属,占28.70%;其次为曲霉属,占11.24%。有83株真菌在加在脱脂奶粉的PDA固体培养板上的菌落周围有一透明圈,表明其可产生分泌胞外蛋白酶。【结论】从中国南海硇洲岛潮间带共分离、鉴定和收集了178株真菌,其中10株可能是新的物种,83株为胞外蛋白酶生产菌。     

一种袋栽黑木耳共生菌的鉴定及其共生效应初步研究

【目的】研究袋栽黑木耳某种共生菌对黑木耳生长的影响。【方法】经分离纯化,以及形态学和分子系统学分析,鉴定该真菌的分类地位;通过不同时间接种共生菌到黑木耳菌棒的方法,研究两者的共生效应;通过子实体营养成分分析,研究共生菌对黑木耳子实体营养结构的影响。【结果】经分离纯化获得菌株B-1,形态学和分子系统学分析将该菌株鉴定为毛色二孢属的可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)。通过不同时间接种黑木耳菌棒发现,此真菌与黑木耳间存在偏性共生关系。它对于黑木耳是偏利共生,还是偏害共生取决于黑木耳菌丝在菌棒中是否具有先占优势。黑木耳子实体营养成分分析显示,可可毛色二孢的存在改变了黑木耳子实体中营养结构,但黑木耳子实体形态特征无明显变化。【结论】可可毛色二孢与袋栽黑木耳存在着偏性共生关系,该现象为首次报道。     

云南干巴菌子实体内可培养微生物

【背景】微生物在菌根真菌的孢子萌发、菌丝体生长、菌根形成以及子实体发育等过程中起到一定作用。【目的】对采自云南省昆明市嵩明县和楚雄彝族自治州禄丰县的8个干巴菌子实体内的微生物进行分离培养鉴定,为后期研究微生物与干巴菌之间的相互作用奠定基础。【方法】采用传统平板分离法从干巴菌子实体内分离获得微生物群落,t检验分析不同地区采集的干巴菌子实体内微生物菌落总数的差异,16S r RNA基因和ITS序列进行系统发育树构建和微生物多样性分析。【结果】采自嵩明县和禄丰县的8个干巴菌子实体内共分离获得282株可培养的细菌,两个地区的细菌菌落总数无显著差异(P=0.22)。所有细菌分属2门12属15种。其中80%的细菌属于变形菌门,且以γ-变形菌为优势菌群,假单胞菌属(Pseudomonas)为优势菌属。其余20%的细菌属于拟杆菌门。从干巴菌子实体中分离获得114株真菌,两个地区的真菌菌落总数无显著差异(P=0.65)。所有真菌分属2门10属10种。其中62%的真菌属于子囊菌门(Ascomycota),并以分离自禄丰县干巴菌子实体内的Lophiostoma为优势属。38%的真菌属于担子菌门(Basidiomycota),并以Asterotremella为优势属。【结论】两个不同地区采集的干巴菌子实体内细菌和真菌在菌落总数上无显著差异。所有细菌都以γ-变形菌为优势菌群,假单胞菌属为优势菌属。嵩明干巴菌子实体内真菌以担子菌门为优势菌群,Asterotremella为优势属。而禄丰干巴菌子实体内真菌则以子囊菌门为优势菌群,Lophiostoma为优势属。     

Aspergillus flavus F52菌株鉴定及不同碳源对曲酸产量的影响

【目的】探明豇豆内生真菌F52的分类地位及不同碳源对曲酸产量的影响。【方法】采用形态观察及ITS序列分析对豇豆内生真菌F52进行分类鉴定;通过重结晶获得曲酸高纯度产物,采用核磁共振波谱、高分辨质谱及红外光谱对其进行结构鉴定;采用高效液相色谱检测不同碳源对曲酸产量的影响。【结果】该曲酸产生菌为黄曲霉Aspergillus flavus F52;葡萄糖与蔗糖组成的复合碳源曲酸产量最高,乳糖的存在不利于曲酸的生成;该菌株发酵液中曲酸含量可达24.44 g/L。【结论】Aspergillus flavus F52是一株具有产业化开发价值的曲酸高产菌株。     

木霉属中国新纪录种Trichoderma pleuroticola和T. pleurotum

【目的】对蔬菜大棚土壤中和阿魏菇腐烂的菌盖上分离的两株木霉菌进行分类鉴定。【方法】结合形态学分类特征和ITS序列分析的方法进行鉴定。【结果】从蔬菜大棚的土壤中和阿魏菇腐烂的菌盖上分离的两株木霉菌分别为Trichoderma pleuroticola和T.pleurotum。T.pleuroticola的形态特征与T.harzianum相似,但其分生孢子显著大于T.harzianum的分生孢子,且在PDA上产生黑褐色的色素以及黄色的结晶物。T.pleurotum典型特征是分生孢子梗单生,有时匍匐,分枝散生,初级分枝和分生孢子梗顶端聚生,类似粘帚霉。【结论】分离的两株木霉分别是T.pleuroticola和T.pleurotum,为木霉菌中国新纪录种。     

一株祁连野生羊肚菌多基因联合分子鉴定及其生物地理分析

【背景】青海野生羊肚菌野生资源丰富,但物种识别度低,相关研究滞后。【目的】鉴定识别采集自青海祁连的野生羊肚菌并分析其生物地理。【方法】利用形态学、多基因谱系一致性系统发育学物种识别法与多基因分子系统学相结合的方法,鉴定野生羊肚菌并分析该物种分化时间和重建祖先区域。【结果】野生羊肚菌菌株MQL-1子实体菌盖呈黄褐色,圆顶,菌柄呈白色、中空,形似羊肚菌,孢子大小为（21.17±4.33）μm×（14.26±3.25）μm,菌丝直径（13.95±3.19）μm。系统发育分析结果表明分离到的菌株MQL-1与羊肚菌属中的黄色羊肚菌类群的内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列相似性高达99%,多基因谱系一致性系统发育学物种识别法将MQL-1识别为粗柄羊肚菌（Morchella crassipes）。分化时间估算和祖先重建结果表明青海祁连粗柄羊肚菌MQL-1与云南M.crassipes M10的分化时间12.75 Mya （百万年前）,其重建的最可能的祖先区域为印度（52.49%）。【结论】本研究得到了一株青海祁连地区粗柄羊肚菌菌株并确定了其正确的科学命名,丰富了青海省羊肚菌资源信息数据库,为后续的工作奠定了基础,也为真菌研究提供新思路。     

南海珊瑚来源真菌Aspergillus sp.SCSIO 40435的分离鉴定及其次级代谢产物研究

【目的】南海珊瑚共附生真菌Aspergillus sp. SCSIO 40435次级代谢产物分离鉴定及抑菌活性筛选。【方法】利用稀释涂布平板法分离珊瑚共附生真菌。采用单菌多代谢产物方法(one strain many compounds,OSMAC)对分离菌株进行化学多样性筛选,并采用滤纸片扩散法对真菌发酵产物进行抑菌活性分析。通过ITS测序鉴定活性菌株SCSIO 40435的分类地位,运用多种色谱手段从其粗提物中分离纯化单体化合物,并利用各种波谱手段(HRESIMS、1D和2D NMR、单晶X-ray衍射法等)确定化合物的结构。最后,采用微量肉汤稀释法对单体化合物的抑菌活性进行评估。【结果】从南海珊瑚样品中分离得到19株共附生真菌,结合化学多样性和抑菌活性分析,筛选出1株产物丰富且具有多种抑菌活性的菌株SCSIO40435。利用ITS测序分析将其鉴定为曲霉属真菌(Aspergillus sp.),进一步从其发酵产物中分离鉴定了4个对三联苯类化合物：dicandidusin A(1)、candidusin A(2)、terphenyllin(3)和4″-deoxyterphenylli...     

南海局部海洋沉积物中真菌多样性及产酶活性

【目的】从11份南海海洋沉积物中分离耐盐真菌,并对其物种多样性及产酶活性进行研究。【方法】利用平板涂布法分离耐盐真菌,基于形态学和ITS序列的系统进化研究耐盐真菌多样性;利用6种筛选培养基对耐盐真菌进行产酶活性筛选。【结果】分离得到1689株耐盐真菌,共41个形态种。形态学和ITS序列分析表明,这些真菌归于15个属,其中曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)为优势菌群。对已测序的41株耐盐真菌的产酶活性研究表明,8株产纤维素酶,9株产淀粉酶,5株产复合酶,16株产蛋白酶,3株产脂肪酶,未发现产壳聚糖酶的菌株,其中Acrodontium sp.8m和Aspergillus sp.86b产复合酶的活性相对较高,而Penicillium sp.41m产蛋白酶的活性相对较高。【结论】南海局部海洋沉积物中耐盐真菌丰富,多数菌株具有产酶活性。     

马尾藻中产不饱和脂肪酸真菌的分离及其脂肪酸组成分析

【背景】随着从鱼类、农作物原料中提取不饱和脂肪酸的成本越来越高,寻找特殊且成本低的提取原料迫在眉睫。海洋环境的特殊性造就了丰富而特有的微生物资源,成为获取产不饱和脂肪酸的新策略。【目的】从湛江徐闻马尾藻中分离筛选产油脂真菌,并对其脂代谢产物进行气相色谱分析(GC)。【方法】通过利用选择性培养基及苏丹黑染色方法从马尾藻中筛选高产油脂真菌,对目标菌进行形态特征、培养特征及ITS序列鉴定,利用GC技术对三氯甲烷-甲醇提取的油脂进行组成成分分析与含油量测定。【结果】共筛选到7株产油脂真菌,其中菌株A17脂肪颗粒大且密集,是一株高产菌株,经形态与基因水平鉴定,确定菌株A17为变红镰孢菌(Fusarium incarnatum)。提取的油脂占细胞干重的24.75%,并且不饱和脂肪酸占总油脂的60.76%,其中油酸与亚油酸分别为32.80%和26.20%。【结论】该研究可为开发马尾藻中产油脂菌株提供理论依据。     

担子菌门总革菌科中国新记录种紫黑点壳菌

[背景] 在陕西省的毛泡桐腐木桩上观察和采集到一株绒毛状真菌子实体,编号为HMNWAFU-CF-HS002。[目的] 为了确定该菌的分类地位,对其进行形态观察及分子鉴定。[方法] 获取宏观彩色图像并对显微结构进行测量、统计和绘图。此外,用PDA培养基分离纯化该菌的培养物,并结合最大似然法、最大简约法和贝叶斯法进行rDNA ITS分子系统学研究。[结果] HMNWAFU-CF-HS002的形态特征与Punctularia atropurpurascens高度相似。系统发育分析将HMNWAFU-CF-HS002聚在P.atropurpurascens的单系分支中。[结论] 结合形态学特征与系统发育结果,HMNWAFU-CF-HS002被鉴定紫黑点壳菌（Punctularia atropurpurascens）,为中国的新记录种。此外,毛泡桐为其新记录寄主。至此,Punctularia属下的3个种,均在中国有分布记录。     

黄颡鱼卵致病性绵霉的分离鉴定与药敏特性

【目的】对黄颡鱼水霉病病原进行分离鉴定,并对其药敏特性进行研究。【方法】参照传统方法对患水霉病的黄颡鱼卵上的丝状真菌进行分离,通过人工感染实验证实分离菌株的致病性,然后根据形态学特征和ITS rDNA序列分析对致病菌株进行鉴定,并进一步采用倍比稀释法研究其药敏特性。【结果】从患水霉病的黄颡鱼卵上分离到8株丝状真菌,经人工感染试验证实菌株YC对黄颡鱼卵具有致病性,并进一步研究了其形态与药敏特性,开展了ITS rDNA序列分析。结果表明,菌株YC为透明管状结构,中间无横隔;游动孢子囊多呈圆筒形、棍棒形或穗状,游动孢子发育成熟后不断从孢子囊顶端释放出来,成团聚集在游动孢子囊口,并经过一个时期的静休后,成团脱落或直接分散在水中游动;次生孢子囊具有典型的侧生现象;藏卵器呈球形或梨形,大多与雄器异枝,少数与雄器同枝,含1?15个卵孢子;成熟卵孢子中生或亚中生,偏生一个大油球。其ITS rDNA序列与GenBank基因库中绵霉属菌株自然聚类,同源性高达99%,与异丝绵霉(Achlya klebsiana)菌株CBS101.49(GenBank登录号AF119579)的亲缘关系最近。结合形态特征与ITS序列鉴定的结果,判定菌株YC为异丝绵霉(Achlya klebsiana)。此外,在实验选用的中草药和消毒剂中,黄连和异噻唑啉酮分别对菌株YC的抑菌效果最好,其对菌株YC的最小抑菌浓度分别为256 mg/L和2 mg/L。【结论】首次分离了黄颡鱼卵致病性异丝绵霉菌株YC,并确定了其药敏特性,可以作为该病防治用药的依据。     

色疣节梗孢属一中国新记录种

【目的】调查我国植物病原真菌资源与多样性。【方法】采用经典真菌形态分类方法并结合序列分析结果对研究样品进行鉴定。【结果】从浙江省绍兴市平水镇的林下枯叶上分离到尖色疣节梗孢,对尖色疣节梗孢的形态特征进行了详细的观察和描述,并对其ITS rDNA序列进行分析。【结论】金缕梅叶斑病的尖色疣节梗孢病原菌在我国是首次发现,为我国真菌新记录种。     

黄颡鱼卵水霉病病原的分离鉴定及其无性繁殖特性

【目的】对黄颡鱼卵水霉病病原进行分离鉴定,并对其无性繁殖特性进行研究。【方法】采用传统方法从患水霉病的黄颡鱼卵上进行丝状真菌的分离,然后通过人工感染实验证实分离菌株的致病性,通过形态学观察和ITS rDNA序列分析对致病菌株进行鉴定,并进一步通过单因子法研究其无性繁殖特性。【结果】从患水霉病的黄颡鱼卵上分离了4株丝状真菌,经人工感染试验证实其中一株丝状真菌HP对黄颡鱼卵具有致病性,并进一步研究了其形态与无性繁殖特性,开展了ITS rDNA序列分析。实验结果表明,菌株HP菌丝为透明管状结构,中间无横隔,分枝较少;游动孢子囊多数呈棒状,游动孢子发育成熟后从孢子囊中释放出来,并迅速游离;能够产生第二孢孢子;新孢子囊以内层出的方式产生;藏卵器呈球形,与雄器同枝或异枝。菌株HP的ITS rDNA序列与GenBank基因库中水霉属菌株自然聚类,同源性高达99%,与多子水霉菌株Arg4S(GenBank登录号GQ119935)的亲缘关系最近。结合形态特征与ITS序列鉴定的结果,判定菌株HP为多子水霉(Saprolegnia ferax)。此外,菌株HP在5°C-35°C、pH 4-10范围内均能产生游动孢子,产生游动孢子的最适温度和pH分别为20°C和7,而且5-25 mg/L福尔马林和0.25 1.25 mg/L二硫氰基甲烷对菌株HP产生游动孢子具有明显的抑制作用。【结论】分离鉴定了黄颡鱼卵水霉病病原,并确定了其无性繁殖特性,可以作为该病防治用药的依据。     

假暗盘菌属一新种——中华假暗盘菌

报道了分离自福建蛇足石杉上的假暗盘菌属Pseudoplectania一新种,中华假暗盘菌Pseudoplectania sinica。基于形态学及分子系统学分析对其进行了鉴定。研究标本保存于齐鲁医药学院实验室和中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。     

广义虫草属二新记录种

【背景】广义虫草属是一类重要的虫生真菌资源。【目的】对我国西南地区虫生真菌及其相关真菌资源进行调查。【方法】在贵州省习水县和花溪区进行标本采集,采用含双抗的PDA培养基分离目的菌株;基于形态学特征和ITS rDNA序列系统发育分析相结合的方法进行菌株鉴定。【结果】从采集到的标本中分离获得5个菌株,菌株GY1113、GY90809和GY90810在形态特征上与马拉维白僵菌模式菌株非常相近;系统发育树中二者以高持率(ML/BI为99/1)聚成一个分支。菌株A1997在形态特征上与鳞翅目虫草模式菌株非常吻合;系统发育树中二者以较高支持率(ML/BI为78/0.95)聚成一个分支。菌株A1972在形态上与苏格兰白僵菌模式菌株的形态特征非常相近;系统发育树中二者以高支持率(ML/BI为99/1)聚成一个分支。因此分别鉴定为马拉维白僵菌、鳞翅目虫草及苏格兰白僵菌。【结论】马拉维白僵菌和鳞翅目虫草为中国新记录种。     

中国栽培白灵菇学名的订正

采用形态学方法对采集于新疆野生的阿魏蘑标本进行分类鉴定,结果表明其形态学特征符合刺芹侧耳托里变种Pleurotus eryngii var. tuoliensis的特征范围,它与欧洲已报道的Pleurotus nebrodensis有明显的差异。此外本研究还采用分子生物学方法对从该野生样品分离的菌株CCMSSC 02514进行了rDNA ITS序列分析,结果表明它与我国栽培白灵菇菌种CCMSSC 00973、KH5和AFRL 6022完全相同,以此构建系统发育树,将我国栽培白灵菇种质与意大利的Pleurotus nebrodensis、Pleurotus eryngii var. ferulae以及来自荷兰的Pleurotus eryngii等截然分为两组。因此,形态学和rDNA ITS序列分析结果支持我国栽培的白灵菇与欧洲的Pleurotus nebrodensis为不同种,我国的白灵菇是刺芹侧耳独立进化的一个分支,其名称应该为刺芹侧耳托里变种Pleurotus eryngii var. tuoliensis。     

来自土壤的金孢属四个新记录种

【背景】金孢属是一类重要的嗜角蛋白真菌资源。【目的】对我国甘肃省和云南省土壤中的金孢属资源进行调查。【方法】采集不同环境中的土壤样品,利用鸡毛和头发对土壤样品中的这类资源进行钓饵,分离目标菌株;基于形态特征和ITSrDNA序列进行系统发育分析相结合的方法进行菌株的鉴定。【结果】从土壤中分离发现5个金孢属菌株,其中菌株H5.11在形态上与节状金孢模式菌株的形态特征非常相近,而且系统发育中与GenBank上报道的该种序列以较高的支持率聚在一个亚分支;H10.10菌株的形态特征与乔治金孢模式标本的形态非常吻合,培养基上均呈现红色,同时系统发育分析结果表明该菌株与GenBank上报道的序列较好的聚在一个亚分支中;EB8803M和EB8801M两个菌株在形态特征上与水生金孢模式标本的描述非常吻合,系统发育分析结果显示它们与网上该种序列能较好地聚在一个亚分支中;O1菌株在形态特征上与轮带金孢模式标本的描述非常吻合,其系统发育表明它与GenBank已报道菌株序列能较好聚在一起。因此将它们鉴定为节状金孢Chrysosporiumarticulatum、乔治金孢C.georgiae、水生金孢C.submersum和轮带金孢C.zonatum。【结论】这4个种均为中国新记录种。     

一株转化大豆苷元为S-雌马酚菌株的筛选和鉴定

【目的】筛选一株可转化大豆苷元为S-雌马酚的微生物菌株,并对该菌株进行鉴定。【方法】在厌氧条件下采用抗生素抑制非目标菌生长并结合稀释涂平板法进行菌株分离,分离可转化大豆苷元生成S-雌马酚的肠道细菌,并对产物进行结构鉴定。之后通过16S rDNA序列分析,构建该菌系统进化树,结合菌体形态及菌落特征,确立该菌系统发育学地位。【结果】从大鼠肠道内筛选分离到一株可以将大豆苷元转化为S-雌马酚的革兰氏阴性兼性厌氧菌株LH-52(JN861767),16S rDNA序列测序结果 BLAST比对表明该菌株与奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)相似度达到了99%,结合形态特征和生理生化实验结果鉴定该菌为奇异变形杆菌。根据HPLC保留时间、质谱、核磁共振等波谱数据分析确定产物为S-雌马酚。【结论】菌株P.mirabilis LH-52为首次筛选到的可转化大豆苷元为S-雌马酚的兼性厌氧菌,相对于文献报道的严格厌氧菌更适合于工业化生产。     

氧化亚铁硫杆菌的分离鉴定及培养条件优化

[目的]获得可用于浸矿的菌株,对其培养条件进行优化.[方法]从成都热电厂采集土样中分离得到一株菌株,分析该菌株的形态学特征、培养特征及16S rDNA序列,确定菌株的分类地位.利用Design-Expert软件中的Box-Behnken法设计实验,通过响应面分析对初始pH值、温度、接种量和装液量4个因素进行优化,确定其最适培养条件.[结果]获得菌株Z1,该菌为革兰氏阴性菌,短杆状,经16S rDNA鉴定为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,简称At.f).确定菌株最适培养条件为:pH 1.8、温度30℃、接种量14％、装液量250 mL摇瓶装60 mL培养液.在此条件下,Z1的亚铁氧化率可达99.7％.[结论]Z1菌株适合于生物浸矿的应用.