人乳头瘤病毒l6型E6-E7融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人乳头瘤病毒l6型(HPV16)E6-E7融合蛋白真核表达载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E6-E7基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,双酶切及测序鉴定。将质粒转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E6-E7基因在HeLa细胞中的表达。提取质粒免疫小鼠,利用免疫组化方法检测在其肌肉组织中的表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7;在转染pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7的细胞中检测到HPV16 E6-E7基因。在免疫该质粒的小鼠肌肉组织中可以检测到该质粒的蛋白表达。结论成功的构建的了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,该载体能在HeLa细胞内以及小鼠骨骼肌细胞内有效表达。     

siRNA沉默HPV18-E7基因表达对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖的影响

研究小干扰RNA(siRNA)沉默18型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus 18,HPV18)E7基因对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖的影响。培养人宫颈癌HeLa细胞株,构建靶向E7基因的两条siRNA,转染HeLa细胞株(实验组:分为siE7-1组和siE7-2组),以不做任何处理的HeLa细胞作为空白对照组(NC),转染无功能siRNA的HeLa细胞作为阴性对照组(Scramble,SCR)。转染48h后,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测转染E7siRNA后HeLa细胞mRNA含量变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测E7蛋白表达量变化;流式细胞术Flow cytometry(FCM)检测HeLa细胞凋亡情况;克隆形成和CCK-8检测HeLa细胞生长增殖情况。与NC组相比,siE7-1组和siE7-2组E7基因mRNA表达明显下调,差异有统计学意义(P0.01);转染48h后,与NC组相比,siE7-1和siE7-2实验组HeLa细胞内HPV18-E7蛋白表达水平明显下降(P0.05);转染48h后,siE7-1组和siE7-2组的细胞凋亡率分别为17.78%和36.44%,与NC组相比明显增多,差异有统计学意义(P0.01),细胞凋亡结果提示siRNA沉默E7促进HeLa细胞凋亡;CCK-8实验结果显示siE7-1组和siE7-2组细胞生长增殖抑制,差异有统计学意义(P0.01);克隆形成实验结果与CCK-8实验结果一致,siE7-1组和siE7-2组HeLa细胞形成的克隆数明显少于NC组,细胞生长增殖抑制(P0.01)。研究结果表明,沉默E7基因促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡,抑制增殖,为宫颈癌治疗提供潜在靶点。     

人乳头瘤病毒16型E7过表达细胞的鉴定及其迁移效应的影响

鉴定人乳头瘤病毒16型早期蛋白7(HPV16E7)过表达细胞及其迁移效应的影响,为后续基于HPV16E7靶向分子作用机制的研究奠定工作基础.脂质体转染法将本室保存的pcDNA3.1-HPV16E7重组真核表达质粒分别转染人胚肾293T细胞(HPV16型DNA阴性)、宫颈癌SiHa细胞株(HPV16 DNA阳性),转染48 h后收集细胞,提取RNA,RT-PCR扩增相应的目的基因,Western Blotting和间接免疫荧光实验检测HPV16E7目的蛋白在细胞中的表达.转染24h的细胞进行细胞划痕和Transwell实验,检测过表达细胞迁移行为的变化.RT-PCR结果显示:分别从E7质粒转染的293T、SiHa细胞的cDNA中,均可扩增到250 bp的目的条带;Western Blotting分析结果显示:以HPV16E7单克隆抗体为检测抗体,转染细胞的裂解液中均能在相对分子质量(Mr)约为15 000处出现特异性目的条带;间接免疫荧光结果显示:转染细胞中均能检测到目的绿色荧光,且分布于胞浆及细胞核周围;细胞划痕和Transwell实验结果显示:转染E7细胞的迁移效应显著提高.本研究证实了 HPV16E7转染细胞后可成功表达,且过表达细胞明显促进了细胞迁移行为,为后续基于HPV16E7迁移相关分子机制及靶向干预等研究奠定了前期工作基础.     

K14和CMV启动子驱动裸鼠体内HPV16 E6/E7基因表达的差异

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）是一种无包膜的环状闭合双链DNA病毒,具有严格的嗜人组织的特性．为探讨不同启动子驱动HPV E6/E7癌蛋白在裸鼠体内不同组织的表达效率,构建了带有角蛋白(K14)启动子和带有巨细胞病毒（CMV）启动子的E6/E7腺病毒载体（pAd-K14-E6/E7和pAd-CMV-E6/E7）,pAd-K14-E6/E7和pAd-CMV-6/E7、以及作为对照的重组腺病毒空载体pAdtrack- K14和pAd-CMV同源重组后,分别在293细胞中包装,收集重组病毒Ad-K14-E6/E7 、Ad-CMV-E6/E7、Adtrack-K14和Ad-CMV,通过尾缘静脉注射到随机分组的裸鼠体内,并每d向裸鼠腹腔注射0.05 mg雌激素．采用RT-PCR和Western 免疫印迹检测不同实验组E6/E7 mRNA 和蛋白表达水平,免疫组化法检测P53和Bcl-2蛋白表达．结果显示,注射病毒Ad-K14-E6/E7（实验组1）裸鼠子宫体中E6/E7 mRNA、E6蛋白质、P53和Bcl-2蛋白高表达,而其它组织中低表达;注射病毒Ad-CMV-E6/E7（实验组2）裸鼠各组织E6/E7　mRNA、E6蛋白质、P53和Bcl-2蛋白均低表达．研究表明,在裸鼠体内角蛋白K14启动子可以调控E6/E7在子宫体中表达,CMV启动子未能诱导E6/E7在子宫体中表达．     

人乳头瘤病毒HPV31型宫颈癌细胞模型的建立

宫颈癌与人乳头瘤病毒感染密切相关,建立宫颈癌实验模型可为宫颈癌的研究提供理想的模拟实验条件。我们通过应用基因重组技术,分别以HPV31型E6和E7基因为目的基因,通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠等获得其特异性检测抗体。我们还通过构建E6和E7基因真核表达载体、转染C33A细胞、博莱霉素抗性筛选和表达检测等步骤,获得一种稳定的体外宫颈癌细胞系。经酶切鉴定及测序证实细胞基因组已重组插入质粒中的目的基因。我们已成功筛选到稳定的目的mRNA和蛋白表达的阳性细胞系,建立了稳定的人乳头状瘤病毒31型(HPV31)的宫颈癌细胞株,为研究宫颈癌提供了体外实验模型。     

Beclin-1 shRNA对低氧诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响

目的：构建Beclin-1基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,感染人SH-SY5Y细胞,观察沉默Beclin-1基因后低氧对SH-SY5Y细胞自噬的影响。方法：构建特异性靶向Beclin-1基因的shRNA慢病毒表达载体和阴性对照序列慢病毒载体;再将载体转染入SH-SY5Y细胞;RT-PCR检测Beclin-1的mRNA表达;Western blot检测Beclin-1蛋白表达;CCK-8法测定Beclin-1 shRNA对SH-SY5Y细胞活力的影响。再将空白对照、阴性对照、转染型三种细胞分别以21%常氧及5%低氧培养,Western blot检测各组细胞LC3蛋白表达;电镜观察自噬小体。结果：Beclin-1 shRNA能明显抑制SH-SY5Y细胞Beclin-1的mRNA及蛋白的表达;沉默Beclin-1基因后,Beclin-1 shRNA组细胞存活率与阴性对照组相比无差异;成功建立了稳定表达Beclin-1 shRNA的SH-SY5Y细胞。5%低氧处理后,与阴性对照组相比较,Beclin-1 shRNA组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下调,细胞内自噬小体数量减少。结论：慢病毒介导的Beclin-1shRNA对SH-SY5Y细胞的活力无影响,但可以抑制低氧诱导的自噬。     

HPV18-E6基因SiRNA对喉癌细胞的生长抑制作用

目的：探讨小分子干扰RNA（SiRNA）对喉癌细胞系Hep-2细胞中人乳头状瘤病毒HPV18型E6基因mRNA表达的干扰作用。方法：用Ambion公司pSilencer4,1CMV构建针对HPV18-E6基因的SiRNA真核表达载体,以携带HPV18-E6基因的人喉癌Hep-2细胞系为靶细胞,通过阳离子脂质体法转染SiRNA表达载体。RT-PCR分析转染后细胞HPV18-E6基因表达：Westernblot试验观察干涉后HPV18-E6蛋白的表达;流式细胞仪分析细胞增殖周期的改变。结果：成功构建了人HPV18-E6基因的RNA干涉真核表达载体psil-svvE6,并在Hep-2细胞中有效地发挥了对HPV18-E6基因表达的干涉作用。细胞周期阻滞于G0／G1期,并诱导细胞凋亡。结论：HPV18-E6基因在喉癌细胞Hep-2生长中可能起到非常重要的作用,有望成为逆转喉癌细胞永生化的靶点。     

HPV18致癌基因E6选择性剪接在宫颈癌中的作用

[目的]探讨HPV18致癌基因E6选择性剪接在宫颈癌细胞中的潜在作用。[方法]HPV18感染或过表达HPV18致癌基因E6后,MTT法检测宫颈癌细胞C-33 A的增殖水平、逆转录PCR和琼脂糖凝胶电泳检测E6选择性剪接产物表达水平、免疫印迹检测E7蛋白表达水平。高通量测序HPV18感染或不感染的C-33 A细胞后调控E6选择性剪接的关键分子。[结果]过表达E6并感染HPV18的C-33 A细胞的增殖水平(2.35±0.37 vs 1.27±0.28)显著上升,且高于未过表达E6(1.27±0.28 vs 0.68±0.11)(P<0.05)。HPV18感染和过表达SRSF3后,选择性剪接产物E6*Ⅰ水平上升(0.25±0.03 vs 0.65±0.13)、E7蛋白表达水平(0.20±0.04 vs 0.77±0.18)上升。敲低SRSF3和过表达miR-1208时,C-33 A细胞的增殖水平(1.30±0.18 vs 0.65±0.13,1.75±0.27 vs 0.75±0.13)显著下降(P<0.05)。与只过表达E6相比,E6与SRSF3共表达、E6过表达同时干扰mi...     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,诱导表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合蛋白。方法:采用PCR方法扩增出HPV58 E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入原核表达载体pET-42a(+)中,构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒进行鉴定;将其转入宿主菌大肠杆菌BL21进行诱导以表达HPV58E6E7融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收HPV58E6E7融合蛋白,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白的相对分子质量及抗原性。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因大小、方向正确;HPV58E6E7融合蛋白得到高效原核表达及纯化,表达蛋白的分子大小正确,抗原性良好。结论:pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒构建成功,HPV58E6E7融合蛋白得到高效表达及有效纯化,为检测HPV58型治疗性疫苗的免疫效果提供了抗原。     

慢病毒介导短发夹ShRNA 沉默ERβ 乳腺癌细胞株的建立

目的:利用慢病毒载体短发夹RNA(shRNA)介导人乳腺癌细胞ERβ基因沉默,筛选鉴定,并建立ERβ基因稳定下调的乳腺癌细胞株。方法:将靶向沉默ERβ基因的shRNA慢病毒颗粒感染人乳腺癌细胞株T47D和MCF-7,以未感染及空载体慢病毒感染的T47D和MCF-7细胞分别作为空白对照和阴性对照。先以慢病毒瞬转48 h,通过蛋白免疫印迹法(western-blot)进行蛋白水平检测筛选出干扰效果最好的两组,然后继续经浓度为1 mg/L的嘌呤霉素连续筛选4周,采用RT-PCR和western-blot方法,分别对ERβ在mRNA和蛋白水平上的沉默效果进行鉴定。结果:慢病毒感染乳腺癌细胞后,与阴性对照组相比,实验组ERβmRNA和蛋白表达量均明显下降(P〈0.05):其中T47D细胞株shRNA3326、3327两实验组下调效果最明显,ERβmRNA水平和蛋白水平分别达到(61.12±3.66)%、(76.47±3.16)%和(60.83±3.07)%、(53.31±3.00)%;MCF-7细胞株shRNA3325、3326两实验组下调效果最显著,ERβmRNA水平和蛋白水平下调率分别为(62.42±0.07)%、(42.49±1.96)%和(83.69±5.07)%、(73.16±13.21)%。而阴性对照与空白对照组相比无显著性差异,无统计学意义(P>0.05)。结论:成功筛选并建立了ERβ基因稳定下调的两株乳腺癌细胞系T47D和MCF-7,从而为后续探究改变ERβ表达水平在乳腺癌发生发展及在乳腺癌内分泌治疗效果中的作用提供有用的细胞研究模型。     

RNA interference against HPV16 E7 oncogene leads to viral E6 and E7 suppression in cervical cancer cells and apoptosis via upregulation of Rb and p53

The simultaneous expression of human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 and E7 oncogenes is pivotal for malignant transformation and maintenance of malignant phenotypes. Silencing these oncogenes is considered to be applicable in molecular therapies of human cervical cancer. However, it remains to be determined whether HPV16 E6 and E7 could be both silenced to obtain most efficient antitumor activity by using RNA interference (RNAi) technology. Herein, we designed a small interfering RNA (siRNA) targeting HPV16-E7 region to degrade either E6, or truncated E6 (E6*) and E7 mRNAs and to simultaneously knockdown both E6 and E7 expression. Firstly, the sequence targeting HPV16-E7 region was inserted into the shRNA packing vector pSIREN-DNR, yielding pSIREN-16E7 to stably express corresponding shRNA. HPV16-transformed SiHa and CaSki cells were used as a model system; RT-PCR, Western Blotting, MTT assay, TUNEL staining, Annexin V apoptosis assay and flow cytometry were applied to examine the effects of pSIREN-16E7. Our results indicated that HPV16-E7 specific shRNA (16E7-shRNA) induced selective degradation of E6 and E7 mRNAs and proteins. E6 silencing induced accumulation of cellular p53 and p21. In contrast, E7 silencing induced hypophosphorylation of retinoblastoma (Rb) protein. The loss of E6 and E7 reduced cell growth and ultimately resulted in massive apoptotic cell death selectively in HPV-positive cancer cells, compared with the HPV-negative ones. We demonstrated that 16E7-shRNA can induce simultaneous E6 and E7 suppression and lead to striking apoptosis in HPV16-related cancer cells by activating cellular p53, p21 and Rb. Therefore, RNAi using E7 shRNA may have the gene-specific therapy potential for HPV16-related cancers.     

CoA Synthase is phosphorylated on tyrosines in mammalian cells, interacts with and is dephosphorylated by Shp2PTP

Currently, strategies aimed at disrupting renin–angiotensin–aldosterone system (RAAS) are extensively investigated for treating liver fibrosis. However, the experiment results remain unsatisfactory, mainly due to excessive level of angiotensin II (AngII) in gene expression. In this article, we aim to investigate whether suppression of AngII-type I receptor (ATIR) expression by short hairpin RNA (shRNA) expression vectors decreases the level of collagen synthesis in hepatic stellate cells (HSCs). Three pairs of ATIR-targeted shRNA expression vectors were transfected into HSC-T6 cells. Compared with the control group, both mRNA and protein levels of ATIR expression were significiently decreased in shRNA-treated groups, and the inhibitory effect exhibited a dose- and time-dependent pattern. Accordingly, TGF-β1 mRNA expression in shRNA1 group was reduced by about 54% compared with the control group. The level of Procollagen type III, hyaluronic acid, and laminin declined by about 46.4, 52.6, and 42%, respectively. In conclusion, shRNA expression vectors targeting ATIR could attenuate collagen synthesis.     

重叠PCR合成HPV16E6、E7基因并构建植物表达双元载体

HPV16型为主的多种HPV病毒可诱发机体发生宫颈癌等疾病,以重叠PCR法人工合成HPV16 E6、E7致癌基因的融合基因,以之为目的基因构建了无选择标记基因(Marker-Free)双元载体,期望转化番茄开发新型宫颈癌治疗性疫苗-转基因植物口服疫苗.通过生物信息学分析HPV16 E6、E7基因,设计并合成密码子优化的靶基因E6-E7融合基因;并在目的基因的上游引入分子佐荆LTB基因,与Kozak序列等表达元件相偶联,以提高目的基因在植物表达系统的表达水平、增强其诱导黏膜免疫的免疫原性.目前已构建pX6-LTB-E7和pX6-LTB-E7-E6两个番茄转化双元载体.采用番茄Marker-Free系统转化和表达HPV16 E6、E7目的基因可以在转化后代中剔除标记基因,从而消除由标记基因可能引起的转基因植物口服疫苗的安全性问题,为HPV转基因植物口服疫苗应用奠定基础.     

靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌CaSki细胞的抑制作用

以RNA干扰技术为手段,HPV编码的癌蛋白E6为靶标．探讨靶向HPV16-E6的siRNA对宫颈癌细胞生物学行为的影响,并试图阐明该实验的临床意义．构建靶向HPV16-E6的siRNA表达载体,应用体外转染试剂转染HPV16-E6阳性的宫颈癌CaSki细胞．以RT—PCR检测CaSki细胞中E6蛋白的mRNA的表达．借助细胞色素c测定来分析细胞凋亡相关分子的表达和活性．从而研究靶向HPV16-E6的siRNA诱导细胞凋亡的分子机制．RT．PCR检测结果表明,将靶向HPV16-E6的siRNA的表达载体瞬时转染到HPV16-E6阳性的CaSki细胞后,其所舍E6蛋白质和mRNA的表达下调;Westernblotting栓出抑凋亡蛋白Bcl．2的表达亦告下调;细胞色素C释放实验结果显示,HPV16-E6siRNA能够诱导细胞色素c从线粒体释放到细胞浆中。从而诱导细胞凋亡．靶向HPV16-E6的siRNA能够有效抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡．靶向HPV16-E6的siRNA为研究重要致瘤蛋白HPV16-E的功能开辟了新途径,给HPV16-E6阳性肿瘤的靶向基因治疗提供新的实验依据．并探索了HPV感染及宫颈癌的新基因疗法．     

Suppression of HPV E6 and E7 expression by BAF53 depletion in cervical cancer cells

Deregulation of the expression of human papillomavirus (HPV) oncogenes E6 and E7 plays a pivotal role in cervical carcinogenesis because the E6 and E7 proteins neutralize p53 and Rb tumor suppressor pathways, respectively. In approximately 90% of all cervical carcinomas, HPVs are found to be integrated into the host genome. Following integration, the core-enhancer element and P105 promoter that control expression of E6 and E7 adopt a chromatin structure that is different from that of episomal HPV, and this has been proposed to contribute to activation of E6 and E7 expression. However, the molecular basis underlying this chromatin structural change remains unknown. Previously, BAF53 has been shown to be essential for the integrity of higher-order chromatin structure and interchromosomal interactions. Here, we examined whether BAF53 is required for activated expression of E6 and E7 genes. We found that BAF53 knockdown led to suppression of expression of E6 and E7 genes from HPV integrants in cervical carcinoma cell lines HeLa and SiHa. Conversely, expression of transiently transfected HPV18-LCR-Luciferase was not suppressed by BAF53 knockdown. The level of the active histone marks H3K9Ac and H4K12Ac on the P105 promoter of integrated HPV 18 was decreased in BAF53 knockdown cells. BAF53 knockdown restored the p53-dependent signaling pathway in HeLa and SiHa cells. These results suggest that activated expression of the E6 and E7 genes of integrated HPV is dependent on BAF53-dependent higher-order chromatin structure or nuclear motor activity.     

不同细胞系中RNA干扰抑制血管内皮生长因子表达

目的通过RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达,并观察在不同细胞系中,RNA干扰作用强度的变化。方法将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2,通过RT-PCR观察VEGF表达受抑的程度及在不同细胞系中RNA干扰作用强度的变化。结果成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,发现其在HEK293和HT29细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,抑制率分别为72%和42%;但在Hela细胞中,抑制作用明显减低至28%;在HepG2细胞中抑制作用更弱,仅为13%。结论针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达,但在不同细胞系中的作用强度有明显差别,提示RNA干扰作用存在明显的细胞系选择性。