人乳头瘤病毒引起裸鼠生殖系统病变的研究

重组的腺病毒Ad-CMV-E6/E7和Ad-K14-E6/E7在293细胞中包装后得到上清液,将Ad-CMV-E6/E7和Ad-K14-E6/E7病毒上清液以及做为对照的重组腺病毒空载体pAd-CMV和pAdtrack-K14的上清液,经过纯化后,通过裸鼠的尾缘静脉注射到裸鼠体内,每天注射0.05 mg雌激素给注射病毒的裸鼠,同时做对照。12周后给裸鼠注射2.5%的阿佛丁进行麻醉,取其子宫、阴道、卵巢、乳腺等组织,浸泡在3.75%的多聚甲醛中4℃固定过夜,做石蜡包埋切片、HE染色、免疫组化检测P53蛋白和Bcl-2蛋白的表达,取裸鼠的各个组织提取DNA、RNA和蛋白质,然后分别检测有无重组腺病毒的感染、病毒表达的情况及E6蛋白的表达。HE染色结果显示注射腺病毒Ad-K14-E6/E7的裸鼠(实验组2)子宫颈-子宫体移行组织增生明显。SP法免疫组化检测突变型P53和Bcl-2在该组裸鼠的子宫基质细胞表达增加,并且RT-PCR检测该组裸鼠子宫组织也有E6/E7的表达,Western Blot检测该组子宫组织也有E6蛋白的表达。动物实验结果表明K14启动子增加了E6/E7在裸鼠子宫组织的表达,同时也发现该组裸鼠的子...     

人乳头瘤病毒E6及E7蛋白研究进展

高危型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）的Ｅ６及Ｅ７蛋白是致瘤蛋白,均有锌指结构,致瘤方式都是作用于抑癌蛋白使细胞周期紊乱,Ｅ６还能激活端粒酶,使细胞不能正常凋亡,对Ｅ６及Ｅ７免疫表位的研究表明,Ｅ７及Ｅ７蛋白的鼠Ｔ细胞表位均在Ｃ端区及锌指区,但其ＨＬＡ－Ａ表位除了存在于锌指区,也存在于Ｎ端区,Ｅ６及Ｅ７蛋白的结构,功能及免疫表位的研究为防治ＨＰＶ疾病奠定了基础。     

不同地区HPV16 E7基因的克隆及序列差异分析

采用PCR扩增、pGEM T载体克隆和核苷酸序列分析的方法对一例武汉地区及两例五峰县高发区宫颈癌患者体内HPV16型的E7基因编码区进行序列分析并与野生型 (德国标准株 )及已发表的HPV16湖北株 (HPVHB)进行了比较。结果发现武汉地区HPV16型E7基因仅第 5 4位出现一个同义突变 ,而高发区HPV16型E7基因存在差异 ,第 77位氨基酸由精氨酸 (Arg)变为半胱氨酸 (Cys) ,第 96位由谷氨酰氨酸 (Gln)变为精氨酸 (Arg) ,E7蛋白的二级结构及亲、疏水性也相应改变 ,与野生型有较大差异     

不同地区HPV16E7基因的克隆及序列差异分析

采用PCR扩增、pGEM-T载体克隆和核苷酸序列分析的方法对一 例武汉地区及两例五峰县高发区宫颈癌患者体内HPV16型的E7基因编码区进行序列分析并与 野生型(德国标准株)及已发表的HPV16湖北株(HPVHB)进行了比较.结果发现武汉地区HPV16 型E7基因仅第54位出现一个同义突变,而高发区HPV16型E7基因存在差异,第77位氨基酸由 精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys),第96位由谷氨酰氨酸(Gln)变为精氨酸(Arg),E7蛋白的二级 结构及亲、疏水性也相应改变,与野生型有较大差异.     

shRNA抑制宫颈癌Hela细胞株HPV18 E6、E7基因表达的研究

应用短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)表达载体抑制宫颈癌Hela细胞株HPV18 E6、E7基因的表达。应用已鉴定的shRNA表达载体pHPV1、pHPV2转染Hela细胞,G418筛选阳性细胞,建立稳定转染细胞株;倒置荧光显微镜检测转染情况;提取细胞内总RNA,RT-PCR方法检测HPV18 E6、E7 mRNA;WesternBlot检测HPV18 E6、E7蛋白表达的变化;采用灰度分析软件对PCR扩增条带与蛋白质条带进行灰度分析。pHPV1实验组细胞内HPV18 E6、E7 mRNA含量分别为阴性对照组的31%、38%,E6、E7蛋白分别为阴性对照组的37%、31%;pHPV2实验组细胞内HPV18 E6、E7 mRNA含量分别为阴性对照组的54%、77%,E6、E7蛋白分别为阴性对照组的52%、83%。pHPV1、pHPV2表达载体能抑制Hela细胞HPV18 E6、E7的表达,针对外显子区434-452的pHPV1抑制作用更强。     

转染人乳头瘤病毒16型E6E7重组基因及感染模型细胞建立

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是性传播疾病的主要病原之一,高危型人乳头瘤病毒感染和宫颈癌的关系已被肯定[1],在约50%~90%的宫颈癌组织中可检出HPV16 DNA。为了解与HPV相关疾病的的分子生物学致病基础,尚待深入研究其生物特性和病理特征,方能逐步解决临床简便易行的试验诊断方法和抗HPV感染的治疗问题。目前已经证实HPV16 E6/E7基因是转化基因,它们编码的蛋白可分别使抑癌蛋白P53和PRb失活,在宫颈癌的发生中起着重要作用[2],被认为是宫颈癌的始动因子。本文选择HPV16 E6E7作为研究对象,利用基因重组技术构建EGFP-…     

人工设计的Ribozymes体外切割HPV16 E6和E7 mRNA的研究

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一类感染人体的皮肤粘膜并引起乳头状瘤病变的病毒。目前发现的HPV已有63型,不同型的HPV引起人体不同部位的病变。HPV 16主要与生殖系统的肿瘤尤其是子宫颈癌有密切关系。近年来的实验表明     

人乳头瘤病毒16型(新疆株)E7基因的克隆与突变研究

目的：克隆分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)新疆株的研基因;并对E7基因进行突变改造,以比较野生型与突变型HPV16E7基因的功能。方法：根据从中国新疆维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取的DNA,进行PCR扩增获得HPV16E7基因,然后分别将其克隆到pMD18-T载体上进行DNA序列分析。根据HPV16E7基因的特点,分别设计点突变引物,用PCR的方法进行HPV16E7基因的点突变。结果：PCR检测显示扩增出HPV16(新疆株)E8基因;测序结果表明HPV16-XJ的研基因全长297bp,与德国标准株一致;利用设计突变位点的引物经PCR扩增,经序列测定后,分别得到了第70、172、271位碱基突变的HPV16E7基因;分别构建了野生型与单、双、三点突变的重组质粒pMD18-T-HPV16E7。结论：人乳头瘤病毒16型(新疆株)E7基因结构与德国标准株相同。HPV16E7基因多点突变的改造,为探索HPV16E7基因功能的变化和开展疫苗研究奠定了理论基础。     

人乳头瘤病毒16型E7基因的体外扩增及其克隆和序列分析

人乳头瘤病毒１６型Ｅ７基因是转化基因。作者设计了一对ＰＣＲ引物,在引物的５′端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切序列,以ＨＰＶ１６ＤＮＡ为模板成功地扩增出Ｅ７基因。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点将Ｅ７基因定向克隆入ｐＵＣ１８载体,经过ＰＣＲ、酶切分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交鉴定得到Ｅ７重组克隆ｐＨＳＥ７、ＤＮＡ序列分析表明所克隆的Ｅ７基因与已发表的ＨＰＶ１６Ｅ７基因序列完全一致且读框正确。     

Human keratin 14 driven HPV 16 E6/E7 transgenic mice exhibit hyperkeratinosis

Human papillomavirus type 16 (HPV16) has been known as a major causative factor for the development of uterine cervical carcinomas. To investigate the in vivo activity of HPV16 expressed in squamous epithelia, transgenic mice harboring HPV16 E6/E7 with human keratin 14 (hK14) promoter were generated. Grossly, hK14 driven HPV16 E6/E7 transgenic mice exhibited multiple phenotypes, including wrinkled skin that was apparent prior to the appearance of hair in neonates, thickened ears, and loss of hair in adults. Transgenic mice with phenotype exhibiting severe wrinkled skin and a lack of hair growth died at the age of 3-4 weeks. Histological analysis revealed that in transgenic mice survived beyond the initial 3-4 weeks, HPV16 E6/E7 causes epidermal hyperplasia in multiple transgenic lineages with high incidence of transgene penetration. This epithelial hyperplasia was characterized by an expansion of the proliferating compartment and keratinocytes, and was associated with hyperkeratosis. Such activities were significantly higher in the skin of transgenic mice than that of the normal mice. Thus, these transgenic mice appeared to be useful for the expression of HPV16 E6/E7 gene and subsequent analysis on hyperkeratosis.     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,诱导表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合蛋白。方法:采用PCR方法扩增出HPV58 E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入原核表达载体pET-42a(+)中,构建pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒进行鉴定;将其转入宿主菌大肠杆菌BL21进行诱导以表达HPV58E6E7融合蛋白,并用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化回收HPV58E6E7融合蛋白,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白的相对分子质量及抗原性。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因大小、方向正确;HPV58E6E7融合蛋白得到高效原核表达及纯化,表达蛋白的分子大小正确,抗原性良好。结论:pET-42a(+)-HPV58E6E7原核表达质粒构建成功,HPV58E6E7融合蛋白得到高效表达及有效纯化,为检测HPV58型治疗性疫苗的免疫效果提供了抗原。     

北京地区宫颈癌HPV16上游调控序列、E6、E7癌基因序列初步分析

为检测HPV16上游调控序列(Upstream regulatory region, URR)、E6、E7癌基因变异在北京地区宫颈癌患者癌组织中的分布特征, 探讨该地区宫颈癌发生同HPV16变异株间的相关性, 文章以提取的31例HPV16检测阳性宫颈癌组织DNA为模板, 设计针对性引物扩增URR、E6、E7 3个目的片段, PCR产物直接测序并通过GenBank对比分析变异和分支鉴定情况。在所分析的宫颈癌组织中, URR是突变频率最高的片段, 其次为E7, 最保守的序列为E6。共发现热突变位点8个, 分别为URR序列上G7521A(100%)、C7435G(96.77%)、C24T(45.16%)、A7729C(45.16%)、G7839A(45.16%); E6序列上T178G(41.94%); E7序列上A647G(45.16%)、T846C(45.16%)。HPV16分支分布频率最广的是As型(54.84%), 其次为E型(45.16%)。研究结果提示, HPV16URR序列上G7521A、A7729C、G7839A, E6序列上T178G、T350G, E7序列上A647G、G658A等位点的变异可能与病毒致癌潜能及宫颈癌的发生相关。北京地区宫颈癌患者中As和E型可能是两种最主要的HPV16分支, 这有可能会为HPV疫苗的研制和感染治疗提供有价值的信息。As型和E型病毒在不同年龄组和不同肿瘤分期组的患者中分布频率有差异, 这可能会为揭示宫颈癌年轻化趋势提供新的线索。