绿色荧光蛋白标记的人乳腺癌细胞株对化疗药物和DC/CIK治疗敏感性的研究

目的:研究绿色荧光蛋白AcGFP基因标记的人乳腺癌细胞株MCF7-pAcGFP对6种化疗药物的敏感性以及DC/CIK对其杀伤活性.方法:应用Fugene HD Transfection Reagent转染MCF-7细胞,经G418筛选获得稳定表达pAcGFP的乳腺癌细胞.采用MTT方法检测MCF7-pAcGFP细胞对6种化疗药物的敏感性以及DC/CIK对MCF7-pAcGFP细胞的杀伤活性.结果:稳定表达pAcGFP的乳腺癌细胞MCF7-pAcGFP对6种化疗药物的敏感性与未转染前相似(P>0.05),均对5-氟尿嘧啶、表柔比星和紫杉醇较为敏感;DC/CIK对MCF7细胞和MCF7-pAcGFP细胞的杀伤能力相同(P>0.05).结论:MCF7-pAcGFP细胞可代替MCF-7细胞用于抗乳腺癌药物筛选.     

Bmi-1稳定干扰增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性

目的:观察Bmi-1稳定干扰后对乳腺癌细胞药敏性的影响.方法:构建Bmi-1 shRNA逆转录病毒表达载体,并用该逆转录病毒感染人乳腺癌细胞,建立Bmi-1稳定干扰的乳腺癌细胞株.采用不同浓度的化疗药物5-氟尿嘧啶和顺铂处理上述细胞,MTT法观察乳腺癌细胞的生长抑制率.结果:免疫印迹检测结果表明Bmi-1稳定干扰的乳腺癌细胞株成功建立.MTT检测显示Bmi-1稳定干扰的乳腺癌细胞(MDA-MB-435S-Bmi-1/RNAi)增殖抑制率显著高于对照细胞(MDA-MB-435S-vector)(P<0.05),并且呈浓度依赖性.其中在MDA-MB-435S-vector中5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50值分别为1.7233 mg/L和2.9065 mg/L,而在MDA-MB-435S Bmi-1/RNAi稳定细胞株5-氟尿嘧啶和顺铂中的IC50值分别为0.9733 mg/L和1.8563mg/L(P<0.05).结论:Bmi-1在乳腺癌细胞对化疗药物敏感性中发挥重要作用,Bmi-1干扰能增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性.     

小干扰RNA抑制LRP16基因表达限制了MCF-7乳腺癌细胞增殖

雌激素雌二醇上调人乳腺癌细胞MCF 7中LRP16基因表达 ,该基因过表达促进MCF 7细胞增殖 .为进一步探讨LRP16基因不同表达水平对MCF 7细胞增殖的影响以及对雌激素的反应性增殖能力 ,采用针对LRP16基因特异的小干扰RNA策略 ,通过逆转录病毒介导及抗性筛选构建了LRP16基因被稳定抑制的 2个MCF 7细胞系 ,针对绿色荧光蛋白的干扰序列作为阴性对照 .Northern印迹实验检测了LRP16基因在各个细胞株中mNRA的水平 ,与对照组细胞比较 ,针对LRP16基因不同位置的 2个小干扰RNA可分别将该基因抑制 90 %和 6 0 % .细胞增殖试验结果显示 ,MCF 7细胞中LRP16基因表达抑制率越高 ,细胞增殖速率减慢越显著 (P <0 0 5 ) ;软琼脂集落形成试验结果显示 ,抑制LRP16基因在MCF 7细胞中表达 ,限制了细胞锚定非依赖性生长 ;细胞周期分析结果表明 ,LRP16基因抑表达使MCF 7细胞G1 S周期转换受抑 ;Western印迹结果表明 ,LRP16基因表达抑制的细胞中细胞周期蛋白E及细胞周期蛋白D1蛋白水平显著下调 ,但未检测到P5 3及Rb蛋白表达水平的影响 .雌二醇刺激的增殖实验结果显示 ,抑制LRP16基因表达没有消除MCF 7细胞的反应性增殖特征 .上述结果表明 ,LRP16基因表达量与MCF 7细胞增殖能力密切相关 ,抑制其表达可有效限制MCF 7细胞的增殖能力 ,提     

端粒酶反义cDNA对乳腺癌细胞恶性表型的影响

 为了进一步探讨端粒酶在肿瘤发生中的作用 ,实验应用反义核酸技术研究端粒酶反义cDNA对乳腺癌细胞MCF 7恶性表型的影响 采用的方法包括 :基因重组、脂质体共转染法获得端粒酶反义重组病毒 ,病毒感染MCF 7后 ,检测细胞的生长曲线、细胞周期及集落形成能力 结果表明 ,与对照组细胞相比 ,反义病毒感染后的MCF 7细胞恶性表型明显降低 提示端粒酶RNA的反义cDNA的导入 ,可以显著抑制乳腺癌细胞恶性表型     

肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合应用对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组蛋白肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与化疗药物5-氟尿嘧啶联合使用在体外对人非小细胞肺癌细胞株A549的作用,为IFN-α2a-NGR的临床实验设计提供实验依据。方法:不同浓度的肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR、5-氟尿嘧啶单独及联合作用于细胞株A549,通过MTT法检测单药及联合用药对细胞增殖的影响,经AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色、流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜观察药物作用的细胞形态。结果:IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合作用于A549细胞株时,其细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均较单独作用时高,具有统计学显著性差异(P<0.05);荧光显微镜观察可见药物作用后细胞形态改变。结论:肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合使用具有协同抑制肿瘤细胞增殖的作用。     

化疗药物对人胃癌SGC-7901细胞系端粒酶活性影响

目的　研究常见化疗药物对人胃癌SGC 790 1细胞系端粒酶活性影响。方法　MTT (噻唑蓝 )法测定化疗药物顺铂、丝裂霉素、阿霉素、 5 氟尿嘧啶、氟铁龙 (脱氧氟尿苷 )对人胃癌SGC 790 1细胞系毒性作用的半数抑制(IC5 0 )浓度 ;用TRAP ELISA法测定 4 0×IC5 0浓度化疗药物作用于SGC 790 1细胞 4h、 2 8h端粒酶活性及IC5 0浓度IC5 0化疗药物作用于SGC 790 1细胞 2 4h、 72h、 12 0h细胞端粒酶活性。结果　高浓度 ,低浓度顺铂、丝裂霉素对SGC 790 1细胞端粒酶活性有完全抑制作用 ;而阿霉素、 5 氟尿嘧啶、氟铁龙对SGC 790 1细胞端粒酶活性有部分抑制作用。结论　阿霉素、 5 氟尿嘧啶、氟铁龙对SGC 790 1细胞端粒酶活性有轻度抑制作用 ;顺铂、丝裂霉素能完全抑制端粒酶活性 ,呈时间浓度效应     

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在乳腺癌细胞移动及粘附中的作用

探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP 2在乳腺癌细胞MCF 7的移动及粘附中的作用 .利用基因重组技术分别将野生型SHP 2与突变型SHP 2与绿色荧光蛋白GFP的基因片段构成重组质粒 (SHP 2 GFP、SHP 2C >S GFP) .脂质体转染法分别转入MCF 7中 ,表达成功后筛选并建立SHP 2 GFP和SHP 2C >S GFP细胞株 .荧光显微镜观察细胞移动情况 ,免疫印迹法检测粘附分子E 钙粘蛋白和金属蛋白酶MMP 1及MMP 9的表达 .实验后建立SHP 2 GFP及SHP 2C >S GFP细胞株 ,同时观察到SHP 2C >S GFP细胞的形态发生明显改变 :从梭形状态变成圆形状态 .荧光显微镜发现 ,MCF 7细胞和SHP 2 GFP、SHP 2C >S GFP转染的细胞在 3h、6h、9h的移动情况分别是MCF 7为 10 %、2 3%、5 4% ,SHP 2 GFP为 15 %、4 9%、98% ,SHP 2C >S GFP为 4 %、11%、30 % .免疫印迹结果表明 ,SHP 2C >S GFP细胞的E 钙粘蛋白表达比SHP 2 GFP细胞明显升高 (P <0 0 5 ) .MMP 1及MMP 9的表达量在SHP 2 GFP细胞中有所增强 (P <0 0 5 ) .实验表明 ,SHP 2可能通过调节粘附分子和基质金属磷酸酶而在细胞移动、粘附中发挥重要作用     

siRNA对乳腺癌细胞Cyclin E表达和生长抑制作用

研究siRNA对乳腺癌MCF-7细胞株cyclin E表达的抑制及对细胞生长的影响。化学合成针对cyclin E基因的小干扰RNA（siRNA）,转染MCF-7细胞株;分别应用荧光定量PCR和免疫印迹测定cyclin E mRNA和蛋白质的表达,CCK-8测定细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期,软琼脂培养检测细胞克隆形成能力。10、50、100nmol／L siRNA-cyclin E分别使MCF-7细胞cyclin E基因表达降低了24．7％、62．5％和71．0％,蛋白质表达降低了40．8％、66．5％和71．3％。转染siRNA-cyclin E后,G1期细胞增多,S期减少,增殖受到抑制,软琼脂克隆形成率降低。结果提示,在MCF-7细胞株中,导入针对cyclin E的siRNA,可有效抑制cyclin E的表达,进而使细胞增殖减缓,逆转其恶性表型。     

雌激素受体α短发夹RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌干细胞的影响

目的:构建特异抑制雌激素受体α(ERα)基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,检测其对ERα的干扰效果,并探讨其对MCF7细胞中乳腺癌干细胞含量的影响。方法:以人的ERα核酸序列为靶标,根据sh RNA设计原则设计并化学合成特异的sh RNA序列,经退火处理后与p SIH-H1质粒连接,转化大肠杆菌DH5α后挑取单克隆并测序;将该克隆进行病毒包装并感染乳腺癌MCF7细胞,用嘌呤霉素进行筛选,最终得到稳定克隆;收取细胞,用Western印迹和q RT-PCR检测ERα在m RNA及蛋白水平上的变化,流式细胞术检测敲低ERα能否影响MCF7乳腺癌干细胞的含量。结果:经测序分析表明目标sh RNA序列成功插入载体,q RT-PCR检测稳定克隆,发现该sh RNA能有效抑制目的基因的m RNA转录水平,同时Western印迹检测发现内源性ERα量明显下降;流式细胞术检测发现ERα敲低的MCF7稳定克隆中雌激素诱导的乳腺癌干细胞含量上升的现象被明显抑制。结论:设计并构建的抑制ERα的sh RNA能够有效抑制ERα的表达,并下调MCF7细胞中乳腺癌干细胞的含量,为研究ERα在乳腺癌干细胞中的功能及机制奠定了实验基础。     

白细胞介素-2受体在乳腺癌MCF-7细胞的表达

目的 :观察乳腺癌MCF 7细胞上白细胞介素 2受体 (IL 2R)α、β和γ链的表达、IL 2对MCF 7细胞增殖的作用及雌激素对三条链表达的影响。方法 :使用特异性IL 2R多克隆抗体以免疫细胞化学方法和流式免疫荧光法检测MCF 7细胞上IL 2R的表达 ,以MTT法及3 H TdR掺入法检测细胞增殖情况。结果 :MCF 7细胞上存在IL 2Rα、β、γ的免疫阳性物质 ,其中IL 2Rγ的表达要强于IL 2Rα、β的表达 ;10 -6mol/L浓度的雌二醇可促进IL 2Rα、β的阳性细胞数及IL 2Rγ的免疫阳性物质的含量 ;IL 2在 10 0U/ml至 10 0 0U/ml的浓度范围内可显著促进MCF 7细胞的增殖。结论 :MCF 7细胞上存在IL 2R且其表达受雌二醇的调节 ,IL 2可能通过IL 2R影响MCF 7细胞的增殖