三叶木通促分裂原活化蛋白激酶基因mapk3的克隆及表达分析

植物MAPK信号途径在植物生长发育以及多种逆境胁迫响应和激素调控过程中发挥着至关重要的作用。本文利用RACE-PCR技术克隆三叶木通促分裂原活化蛋白激酶基因mapk3的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析和时空表达分析。克隆所得的Aktmapk3基因的ORF全长序列为1 164 bp,编码387个氨基酸,其编码的蛋白具有ATP结合位点,MAPK激酶保守结构和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活位点,推测其可能通过被磷酸化而激活以及通过磷酸化下游蛋白而执行生理功能。实时荧光定量PCR结果显示,Aktmapk3基因在三叶木通各组织器官均有表达,在芽成熟叶片以及花中表达量比较高,在茎、幼叶和果肉中的表达量最低,暗示该基因可能参与了三叶木通芽的形成和花的发育。     

小桐子JcCIPK2基因的克隆与表达分析

钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPK)是一类植物中特有的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,参与多种生物和非生物胁迫响应过程。该实验通过RT-PCR克隆了小桐子(Jatropha curcas L.)JcCIPK2基因cDNA全长序列,采用荧光定量qRT-PCR分析JcCIPK2基因在不同组织及不同处理(12℃和1℃低温、42℃高温、30%PEG、250 mmol/L NaCl、150μmol/L ABA)下的表达模式。结果显示:(1)小桐子JcCIPK2基因开放阅读框全长1 398 bp,编码465个氨基酸,相对分子量为52.95 kD,等电点为8.89。(2)蛋白质结构分析表明,JcCIPK2的N端含有位于第11～265个氨基酸之间的丝氨酸/苏氨酸激酶_蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶3催化域STKc_SnRK3,在激酶结构域内还具有激活环(Activation Loop);C端含有位于第316～430个氨基酸之间的CIPK蛋白激酶调控域CIPK_C,其调控域中含有CIPK家族典型的能与CBL特异性结合的NAF结构域,位于第314～369个氨基酸之间。(3)系统进化分析显示,小桐子JcCIPK2蛋白与同属于大戟科的木薯(Manihot esculenta Crantz.)同源关系最近,序列一致性达87%。(4)qRT-PCR分析表明,JcCIPK2基因在小桐子根、茎、叶中均有表达,经12℃和1℃低温处理后,叶片中JcCIPK2基因的表达都呈现先上调后下调表达的趋势,且都在低温处理24 h的表达量最高,与对照相比分别上调了6.0倍和16.72倍;小桐子JcCIPK2基因在42℃高温、30%PEG、150μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl处理下也受到不同程度的诱导表达。研究推测,JcCIPK2基因在小桐子对逆境的响应与适应中起重要作用。     

菜用大豆CIPK基因对逆境胁迫及激素的响应特征

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应逆境胁迫和激素信号转导中发挥重要作用。本研究利用大豆基因组数据库,在全基因组水平鉴定获得52个CIPK蛋白激酶。蛋白比对分析发现所有Gm CIPK含有高度保守特征性的N端激酶区、连接区和C端调控区。系统进化树分析发现大豆Gm CIPK与拟南芥、水稻CIPK分类一致,分为4个亚家族,且每个亚家族含有3个不同物种的成员,表明Gm CIPK基因的分化早于物种的分化。启动子分析表明,多数Gm CIPK基因的启动子区含有逆境和激素应答元件。组织表达分析发现,Gm CIPK基因呈现多样化的组织表达特性。进一步选取组织表达量相对较高的14个Gm CIPK进行荧光定量PCR分析,结果表明这些菜用大豆CIPK基因在不同程度上均受高温、干旱、高盐胁迫以及ABA、ACC、SA、Me JA激素的诱导表达。采用蛋白同源比对和蛋白互作在线数据库对拟南芥及大豆同源CIPK蛋白激酶与其他蛋白的互作关系进行了预测分析,发现17对同源CIPK与其他蛋白(激酶、磷酸酶、转录因子等)存在互作。本研究为菜用大豆CIPK基因的功能研究与利用奠定了基础。     

ATHKl基因调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程

以拟南芥ATHKl基因T-DNA插入所产生的缺失突变体和野生型ws(wassilewskija)生态型为材料,分析了它们在生理和基因表达方面的差异.结果表明突变体的离体叶片失水率明显大于野生型;在30%PEG-6000胁迫后,野生型和ATHKJ突变体的细胞膜离子外渗率比胁迫前分别增加了50%和80%.PEG胁迫48 h时突变体的萎蔫程度明显大于野生型ws.以上结果说明ATHKl突变体的抗渗透胁迫能力低于野生型,即ATHKl基因参与了拟南芥适应逆境的调节反应.利用DDRT-PCR技术研究二者在PEG胁迫36h后的基因表达差异,分离到9个在野生型中被PEG诱导表达而在突变体中未被诱导的参与逆境应答的基因片段,其中包括MAPKKKl8和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,即ATHKJ基因失活引起下游基因响应渗透胁迫的能力减弱,进一步说明ATHKJ基因参与拟南芥适应逆境的调节反应,并且ATHKl可能在逆境信号转导组分MAPK的上游起作用,很可能是植物体中的渗透感受器.     

林烟草蛋白激酶NsylCIPK3基因的克隆与功能分析

CIPK蛋白激酶家族(CBL-interacting protein kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,与类钙调磷酸酶B亚基CBL(calcineurin B-like protein)蛋白共同形成CBL-CIPK网络,在植物的生长发育和逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。烟草中该家族的研究还比较少,本研究从林烟草(Nicotiana sylvestris)中获得一个CIPK家族基因,该基因与拟南芥和杨树中的CIPK3同源性分别为68.4%和87.5%,将其命名为Nsyl CIPK3。氨基酸序列分析表明,Nsyl CIPK3具有CIPK蛋白家族的典型结构特征,在N端和C端分别具有典型的激活环结构域和NAF结构域。进化树分析显示,Nsyl CIPK3属于CIPK蛋白亚家族Ⅱ。表达模式研究表明,该基因在林烟草的叶和腋芽中的表达量相对较高,在主根中的表达量次之,在侧根、茎、花瓣和萼片中的表达量相对较低,并且在烟草成熟期的叶中表达量明显升高。在高盐、紫外光和低钾胁迫下该基因的表达发生不同程度的上调。酵母双杂交结果显示,Nsyl CIPK3可与Nsyl CBL9互作。推测Nsyl CIPK3可能通过与Nsyl CBL9互作形成信号通路,激活下游靶蛋白,参与烟草响应非生物逆境胁迫的信号转导过程。     

棘孢木霉丝裂原活化蛋白激酶基因task1的克隆及序列分析

为深入研究丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)的功能,从棘孢木霉(Tricho-derma asperellum)中克隆了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因task1,并对其序列进行分析。该基因编码355个氨基酸,全长1 757 bp,理论分子质量41.1 kD,理论等电点为6.64,与深绿木霉(T.atroviride)MAPK基因tmk1、里氏木霉(T.reesei)MAPK基因tmkA和绿色木霉(T.virens)MAPK基因tmkA在氨基酸和核苷酸水平上同源性都很高,蛋白结构预测为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。     

小麦TaMAPK2基因的克隆及表达分析

该研究从小麦中克隆了1个MAPK基因TaMAPK2。序列分析表明,TaMAPK2基因的ORF为1 110bp,编码369个氨基酸。序列比对分析表明,该基因所编码的蛋白与粗山羊草、水稻、谷子等MAPK蛋白具有较高的一致性,分别为99%、94%、94%。进化树分析表明,TaMAPK2与水稻OsMAPK2的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、乙烯和双氧水诱导,受ABA抑制。研究表明,TaMAPK2可能参与非生物逆境胁迫及相关信号分子应答。     

紫花苜蓿MsCIPK8基因的克隆与表达分析

CIPK是植物中一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用。本研究根据盐碱胁迫下紫花苜蓿(Medicago sativa L.)转录组数据设计引物,通过RT-PCR克隆获得紫花苜蓿MsCIPK8基因,该基因CDS全长1341bp,编码446个氨基酸,编码蛋白相对分子质量50.73 kD,等电点6.72,具有CIPKS家族蛋白所特有的N端激酶域和C端NAF/FISL结构域。生物信息学分析结果显示,MsCIPK8为可溶性蛋白,二级结构多为无规矩卷曲;系统进化分析表明,紫花苜蓿MsCIPK8与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)MtCIPK8亲缘关系最近。两个蛋白序列比对发现存在4个差异位点,其中3个在保守结构域内。MsCIPK8在低温、干旱、盐和盐碱胁迫下表达量均受到诱导上调表达。低温胁迫下,MsCIPK8在根和叶中的表达量分别在12 h和3 h达到峰值;盐胁迫下,MsCIPK8在根中的表达量12 h达到峰值;盐碱胁迫下,根和叶中MsCIPK8的表达量在12 h后持续高表达;干旱胁迫下,MsCIPK8在根和叶中的表达量在12 h均达到峰值。上述结果表明MsCIPK8参与紫花苜蓿对干旱、低温、盐和盐碱等非生物胁迫的应答。     

大叶落地生根类糖原合成激酶KdSK基因的克隆与表达分析

类糖原合成酶激酶(SKs)属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,在植物器官发育、激素信号传导过程中十分重要,并参与生物胁迫、非生物胁迫的应答过程。大叶落地生根中的胎生苗发育过程,同时具备胚胎发生和器官发生的特征,是研究无性生殖的理想模型。为了更好地理解大叶落地生根中胎生苗发育的分子机制,该研究利用RACE-PCR技术,从大叶落地生根中克隆了1个新的基因KdSK。该基因具有423个氨基酸残基,分子量为47.79 kD,等电点为8.37,其开放阅读框长为1 272 bp。其蛋白与黄瓜的同源性最高,属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ类,与苜蓿(MSK4)蛋白在进化关系上最近,且与拟南芥(AtSK4-1、AtKSK4-2)聚为一枝。保守域结构分析表明,KdSK蛋白具有明显的蛋白激酶的结构域,包括蛋白激酶的ATP结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化结构域。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在大叶落地生根的根中表达量最高,且受渗透胁迫(甘露醇)的诱导上调表达。该研究首次从大叶落地生根中克隆出KdSK基因,该研究结果为进一步研究该基因的功能打下了基础。     

葡萄VvBAP1基因的克隆及表达特性分析

以抗性葡萄品种‘F-242’组培苗为材料, 利用同源克隆法克隆了葡萄VvBAP1基因。测序结果显示, VvBAP1扩增片段大小为531 bp, 可编码176个氨基酸序列。利用生物信息学分析VvBAP1基因编码的蛋白序列显示, 该蛋白分子量为19.43 kDa, 含有保守的钙离子依赖性的C2结构域; 等电点pI为9.42; 不稳定系数为37.09, 推测为稳定的亲水性蛋白; 含有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR表明, 该基因在根茎叶中均有表达, 其中在叶片中表达量较高; 盐胁迫、低温等逆境因子及逆境相关的信号物质, 如水杨酸和一氧化氮均可诱导VvBAP1的表达, 其中低温对其表达量影响更为显著, 推测该基因参与了葡萄抵御逆境胁迫的过程, 尤其是与低温相关的过程。     

番茄LeCIPK3的克隆及非生物胁迫诱导的表达分析

CIPK是植物钙感受器蛋白钙调磷酸酶B类似蛋白特定靶向的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。采用同源基因克隆法,在番茄叶中克隆了一个与AtCIPK3处于同一亚组的基因,命名为LeCIPK3。表达分析表明,LeCIPK3主要在根和花中表达,在叶中的表达受脱落酸、聚乙二醇及低温的诱导,可能在番茄多种胁迫抗性中起重要作用。     

玉米中一种新的蛋白激酶电子克隆与序列分析

目的：电子克隆玉米中一种新的蛋白激酶基因。方法：以拟南芥中一个蛋白激酶的氨基酸序列为探针,对玉米的EST数据库进行同源性检索和筛选并克隆。结果：序列分析显示该cDNA长1121bp,有一个450bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,且具有保守苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶结构域和TEY基元,说明所克隆的cDNA序列为玉米的MAPK全长cDNA。结论：所克隆的cDNA序列为玉米的MAPK全长cDNA。     

地黄RgCDPK基因的克隆与表达分析

钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)是高等植物细胞中重要的钙离子信号受体,在植物抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用。该研究以地黄为材料,设计特异引物,克隆地黄RgCDPK基因全长序列,并使用在线软件进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR技术进行组织特异性分析。结果表明:(1)克隆得到的地黄CDPK基因长度为1 770 bp,编码589个氨基酸;(2)多序列比对和结构分析显示,该蛋白含有钙依赖蛋白激酶典型结构域丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区及EF-手性区。系统进化分析表明其与拟南芥 AtCDPK28 的同源关系最近,因此命名为RgCDPK(Genbank登录号为MT024235);(3)组织特异性分析得出RgCDPK在地黄叶中表达量最高。该研究成功克隆出地黄CDPK基因,且发现该基因在不同组织中的表达存在差异,为以后深入研究CDPK在地黄连作障碍等生物及非生物胁迫中的分子机制提供理论基础。     

MAPK级联及其在植物抗病防卫反应中的研究进展

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号转导途径参与了生物体生长发育和抗逆胁迫生理。植物MAPK级联途径一般由三个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组分构成:包括MAPKKK(MEKK、MAP3K)、MAPKK(MEK)和MAPK。植物在响应外界环境刺激时,MAPKKK首先被自磷酸化激活,依次通过磷酸化激活MAPKK和MAPK,进而将外界信号在细胞内传递从而调控目标基因的表达。MAPK级联途径参与植物激素、生物胁迫、非生物胁迫等过程的信号传递,本文就MAPK级联途径在植物抗病防卫反应中的研究进展进行综述。     

非生物逆境胁迫相关NAC转录因子的生物信息学分析

通过生物信息学手段,对22种NAC蛋白(14种非生物逆境胁迫相关NAC蛋白、8种涉及不同生物学功能的NAC蛋白)进行氨基酸序列比对和系统发生树构建,对14种非生物逆境胁迫相关NAC蛋白氨基酸组成、理化性质、亲/疏水性、保守结构域、亚细胞定位、二级结构及三级结构等进行了分析、预测。结果显示,22个NAC蛋白中,非生物逆境相关的NAC蛋白聚成一类,其余NAC蛋白聚为另一类;非生物逆境胁迫相关的NAC蛋白序列分析显示,N-端具有A、B、C、D、E 5个保守的亚结构域,共同组成NAC结构域,C-端含有多个保守的酸性氨基酸位点,具有转录激活功能,同时蛋白中含有多个丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)磷酸化位点;非生物逆境胁迫相关NAC蛋白主要亲水区域位于A、C、D亚域,大多定位于细胞核,个别定位于细胞质或线粒体,二级结构则以α-螺旋和β-折叠片为主;拟南芥RD26和ANAC三级结构上的一致性暗示了功能上的相似。     

球孢白僵菌Hog1 MAPK同源基因BbHog1的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌Hog1 MAPK的保守氨基酸序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK同源基因的部分片段,然后利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK编码基因的全长序列,命名为BbHog1。序列分析表明,该基因编码358个氨基酸的多肽,推测分子量为40.99kDa,等电点为5.49。BbHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY),序列与粗糙脉孢霉os-2(AF297032)、烟曲霉OSM1(XM_747571)、隐球酵母HOG1(AF243531)和酿酒酵母Hog1(Z73285)等Hog1 MAPK高度同源,相似性分别为94%、89%、83%和80%。系统聚类结果表明,BbHog1与酵母Hog1 MAPK同源。Southern杂交表明,BbHog1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。Northern分析表明,BbHog1在高渗、亚高温和营养胁迫等条件下的表达明显升高。由此推测,BbHog1基因可能与球孢白僵菌对逆境胁迫的适应性调节密切相关。     

植物体中的MAPK

促细胞分裂剂激活性蛋白激酶（MAPK）是一类存在于各种真核生物体中的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶。它被上游激活因子MAPKK磷酸化而激活,并通过将底物蛋白上的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化而传递信号。它与其他一些信号分子组成MAPK级联信号通路,接受外界刺激信号,将信号转入细胞内,影响特定基因的表达,它的作用受到不同因子的调节。本文介绍了植物体中的MAPK的结构特点、作用机理、生物功能以及MAPK级联信号通路的调节。     

胡杨PeECT8基因的克隆及功能分析

ECT基因家族已在拟南芥中被发现并报道,然而它们是否参与植物在逆境胁迫下的响应过程却鲜有报道。为研究胡杨PeECT8基因的功能,从胡杨叶片cDNA中克隆出PeECT8基因,构建CaMV 35S::Pe ECT8植物表达载体,利用花序浸染法转化拟南芥,经GUS组织化学染色和PCR检测,获得转基因植株,进而测定不同浓度盐(Na Cl)和甘露醇胁迫下转基因拟南芥种子的萌发率、生长势和根长。测序结果表明,该基因编码区长度为1821 bp,可编码606个氨基酸。蛋白序列比对发现,PeECT8基因与毛果杨PtrECT8同源基因所编码的氨基酸一致性达93.42%,PeECT8蛋白包含一个YT521-B-like保守结构域。相比于野生型,过量表达PeECT8的拟南芥在不同浓度NaCl胁迫下萌发率降低,在D-甘露醇胁迫下萌发率没有明显变化。在NaCl和D-甘露醇胁迫下,转基因拟南芥根的伸长长度小于野生型。这表明PeECT8基因在盐胁迫和渗透胁迫下发挥负调控的作用。     

植物体中的MAPK

促细胞分裂剂激活性蛋白激酶(MAPK)是一类存在于各种真核生物体中的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶.它被上游激活因子MAPKK磷酸化而激活,并通过将底物蛋白上的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化而传递信号.它与其他一些信号分子组成MAPK级联信号通路,接受外界刺激信号,将信号转入细胞内,影响特定基因的表达,它的作用受到不同因子的调节.本文介绍了植物体中的MAPK的结构特点、作用机理、生物功能以及MAPK级联信号通路的调节.     

烟草氧化胁迫相关基因NtOSA1的克隆表达及亚细胞定位分析

植物类蛋白激酶Abc1家族(activity of bc1complex)在植物生长发育及响应非生物胁迫中起着重要的作用。该研究通过将拟南芥AtOSA1蛋白氨基酸序列与烟草转录组数据进行比对,利用巢式PCR技术克隆得到1个烟草氧化胁迫相关Abc1家族基因NtOSA1,NtOSA1与拟南芥AtOSA1基因具有72.89%的一致性。NtOSA1基因开放阅读框长度为2 283bp,编码760个氨基酸,含有典型的ABC1结构域、一个激酶结构域、叶绿体定位信号肽和两个跨膜结构域。采用实时荧光定量PCR技术,对NtOSA1基因在烟草不同组织以及氧化胁迫、盐胁迫等处理下的表达分析表明:NtOSA1基因的表达具有组织特异性,主要在叶片中表达;NtOSA1基因在H2O2和NaCl处理后表达量上升,均在处理后6h达到最大值,分别为处理前的1.95和2.69倍。亚细胞定位结果表明,NtOSA1蛋白定位在细胞叶绿体上,与预测结果一致。研究表明,NtOSA1基因参与了烟草抗氧化胁迫和盐胁迫的响应。