米曲霉原生质体的营养互补融合及二倍体的诱发分离

采用1％溶壁酶加1％蜗牛酶的混合液获得的原生质体,以30％聚乙二醇(MW=6,000)、0.01M CaCl_2、0.05M Gly做为融合剂,对米曲霉进行了原生质体的营养互补融合,融合频率为0.27—0.47％。自4个菌株的4对杂交组合中获得了异核体,并分离到97株绿色融合株。二倍体的孢子经PFA和UV诱发分离后,获得了二株生长速度快、蛋白酶活性高和产孢能力强的单倍体菌株。     

米曲霉原生质体的营养互补融合及二倍体的诱发分离*

采用1％溶壁酶加1％蜗牛酶的混合液获得的原生质体,以30％聚乙二醇(MW=6,000)、0.01M CaCl_2、0.05M Gly做为融合剂,对米曲霉进行了原生质体的营养互补融合,融合频率为0.27—0.47％。自4个菌株的4对杂交组合中获得了异核体,并分离到97株绿色融合株。二倍体的孢子经PFA和UV诱发分离后,获得了二株生长速度快、蛋白酶活性高和产孢能力强的单倍体菌株。     

抗生素

研究了原生质体的形成对灰色链霉菌 (Streptomyces griseus)灰霉素合成的影响。对用于筛选高产、抗噬菌体的两株不同菌株的原生质体融合的可能用途进行     

林青链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究

分别以紫外线、热灭活性林肯链霉菌947和9502原生质体,然后进行灭活双亲的原生质体融合,从16株融合子筛选到林青霉素高产株。用双亲的互补营养缺陷型对林肯链霉菌原生质体的制备、融合、再生的部分条件进行了研究。发现含0．4％Gly和34％蔗糖的SM培养基最适于实验菌株原生质体的制备、再生。聚乙二醇（PEG）分子量对原生质体融合影响不大,其在P缓冲液中的浓度却很重要。含50％PEG的P缓冲液最有利于原生质体融合。     

林肯链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究

分别以紫外线、热灭活林肯链霉菌 94 7和 95 0 2原生质体 ,然后进行灭活双亲的原生质体融合 ,从 1 6株融合子筛选到林肯霉素高产株。用双亲的互补营养缺陷型对林肯链霉菌原生质体的制备、融合、再生的部分条件进行了研究。发现含 0 .4 %Gly和 34 %蔗糖的SM培养基最适于实验菌株原生质体的制备、再生。聚乙二醇 (PEG)分子量对原生质体融合影响不大 ,其在P缓冲液中的浓度却很重要。含 5 0 %PEG的P缓冲液最有利于原生质体融合     

优良啤酒酵母原生质体融合株GR5的构建及其发酵特性

以发酵度较高的非絮凝性的啤酒酵母菌株X6和发酵度较低、絮凝性较强的啤酒酵母菌株N1为亲本进行原生质体融合。用亚硝酸诱变原养型的菌株X6,经筛选得到一株需酪素水解物的营养缺陷型菌株X6~20。采用正交试验法分别优化菌株X6~20和N1的原生质体形成和再生的条件。用X6~20菌株的原生质体作为受体和热灭活的N1菌株原生质体作为供体进行融合。融合株经三角瓶发酵筛选,得到一株较优良的融合株GR5。该融合株的絮凝性较强(本斯值为2.7),以12°Bx麦芽汁为培养基,用500 L的发酵罐在12℃下发酵,发酵至第8 d菌株GR5的发酵度为69.2%,发酵液中的双乙酰含量为0.0498 mg/L、乙醛含量为6.34 mg/L,总高级醇含量为74.4mg/L。融合株GR5具有双亲的优点,发酵的啤酒风味较好,是一株具有工业应用前景的啤酒酿造酵母菌株。     

荧光标记香菇原生质体融合菌株的鉴定

以异硫氰基荧光素（FITC）标记和香菇单核L4菌株的原生质体和未经标记的香菇单核B14菌株的原生质体为亲本,在聚乙二醇（PEG）的促融下进行融合,选取一个带有荧光,另一个不带荧光的原生质体粘合对进行再生培养,通过对利用“锁状联合”筛选得到的菌株进行鉴定后表明：融合菌株为双核菌丝,与双亲产生明显拮抗,其酯酶同工酶及可溶性蛋白质凝胶电泳图谱分析表明融合菌株均与双亲有区别,经琼脂平板快速出菇及出菇实验证明融合菌株出菇早,产量有所提高。     

香菇和侧耳属间原生质体的电融合研究

从培养在液体培养基中的香菇、美味侧耳和平菇的单核菌丝用酶法分离了原生质体。施加0.5MHz、500PV/cm的正弦波和μs、6000PV/cm方形脉冲的电场诱导下使其电融合。电融合后的融合子和原生质体在固体培养基上植板培养成菌落。在显微镜下检查融合子菌株菌丝的锁状联合选出从融合子长成的菌株。香菇和美味侧耳的融合菌株产生频率为61.53%,香菇和平菇的融合菌株产生频率为32.58%。根据融合菌株与亲本的拮抗作用和他们的过氧化物同工酶和酯酶同工酶的电泳酶谱与其亲本酶谱的不同,证实这些融合菌株是从融合的异核体生长成的。同时讨论了电融合方法和结果。     

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)原生质体融合育种研究

为了提高丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的丁醇耐受能力和培养基总糖产丁醇的转化率,通过原生质体融合的方法,研究了溶菌酶浓度及其作用时间、再生培养基种类、55℃条件下菌体致死时间、不同PEG分子量以及作用时间、Ca^2+和Mg^2+不同的添加量对丙酮丁醇梭菌原生质体制备、融合、再生的影响,得到了一套比较系统的丙酮丁醇梭菌的原生质体融合条件,同时通过气相色谱检测了融合菌的产溶剂能力并计算总糖转化率。结果显示,最终得到的215I菌株的总糖转化率比原始菌株提高了34.7%,产丁醇能力比原始菌株提高了32.2%,并且发现1株融合菌能产生新物质。原生质体融合方法在丙酸丁醇梭菌育种方面有广泛的应用潜力,通过融合得到的菌株为丁醇生产奠定了基础。     

金针菇原生质体分离制备、融合、再生及融合子检出

探讨了利用金针菇菌丝体分离、制备原生质体;不同的酶浓度和酶解时间对原生质体得率的影响;以及八种再生培养基的选择性试验.建立了金针菇原生质体的分离、制备、融合及再生的试验体系.试验共获得209株再生菌株,通过核染色检测,共获得37株具有双核和锁状联合的再生株.     

树状多节孢的双亲灭活原生质体融合*

以紫杉醇产生菌树状多节孢HQD33的诱发突变株UL50-6和UL40-19 为出发菌株,将收集到的出发菌株UL50-6和UL40-19的菌丝体分别用pH5.5~6.0的0.7mol/L NaCl配制的3%溶壁酶、2%蜗牛酶、1%溶菌酶组成的复合酶系,30℃恒温酶解3~5h,制备原生质体。两菌株的原生质体经纯化后分别用热和紫外线灭活,其中UL50-6的原生质体在54℃热灭活5分钟,UL40-19的原生质体在30W紫外灯下,30cm,照射85秒进行紫外灭活,双亲株的原生质体存活再生率为零。同时对融合条件进行了初步探索,以含有Ca2 和Gly的35%~40%的PEG作为融合剂,融合时间为20分钟时,融合率可以达到4.44?0-2~6.92?0-2。对融合株TPF-1与双亲株的形态学、可溶性蛋白、过氧化物同工酶进行分析,确证其为双亲株的融合子。     

斑玉蕈重组异核体菌株节孢子遗传转化效率差异性分析

在斑玉蕈Hypsizygusmarmoreus双核体菌株原生质体单核化过程中会存在大量出现的单核体和极少出现的单核体。为方便研究,将大量出现的单核体定义为强势核,极少出现的单核体定义为弱势核。为了研究这些不同类型的细胞核对斑玉蕈节孢子遗传转化效率的影响,将本研究室前期原生质体单核化工作中分离的10株强势核单核体和弱势核单核体菌株分别进行两两配对杂交,获得5株强势核重组异核体构成供试菌株Q组,以及5株弱势核重组异核体构成供试菌株R组,利用这些新的重组异核体菌株展开节孢子遗传转化实验。实验统计结果显示,Q组中5株强势核重组异核体Q1A、Q1B、Q2A、Q3A和Q3B的转化效率分别为81%、59%、57%、56%和53%,R组中的5株弱势核重组异核体R1A、R2A、R2B、R3B和R4B的转化效率分别为45%、45%、44%、46%和41%,Q组5株强势核重组异核体的转化效率均高于R组5株弱势核重组异核体,且Q组菌株的平均转化效率为61%,显著高于R组的平均转化效率44%。这种单核菌株间遗传转化效率存在明显差异的机制还需要进一步研究。     

棒状杆菌原生质体的形成、再生以及融合的初步探讨

Corynebacterium 属中的一些种是生产氨基酸的重要菌株。它们对蛋清I容菌酶和其他几种酶均不敏感。作者用0.4—0.8u／ml青霉素G处理对数期菌令菌体,可明显增加对蛋清溶菌酶的敏感性。继而用0.5—1.0mg／ml的蛋清溶菌酶,于37℃,12—15小时保温,渗透压敏感细胞可达99％以上。在丁二酸钠高渗完全培养平皿上,原生质体再生率可达20％。C. pekinenseAS 1.563与C. crenutum 82原生质体融合率为3×10-4 每对原生质体。融合菌株不稳定呈现出不同程度的分离现象。对融合菌株发酵产物——氨基酸进行了纸层析,70％的融合株同时产生两亲株所产的氨基酸,10％菌株不产生两亲株所产的氨基酸。通过光学显微镜和电镜技术,观察了原生质体的形成、再生和原生质体聚集现象。     

酿酒酵母单倍体与双倍体原生质体的融合

本文报道用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生质体融合,得到营养互补的融合子为三倍体,其生长速度、发酵速率均较亲株提高1—2倍。部分融合子酒精的产量高于亲株,同时高于目前使用的酒精发酵生产菌株。     

酿酒酵母单倍体与双倍体原生质体的融合*

本文报道用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生质体融合,得到营养互补的融合子为三倍体,其生长速度、发酵速率均较亲株提高1—2倍。部分融合子酒精的产量高于亲株,同时高于目前使用的酒精发酵生产菌株。     

提高枯草杆菌原生质体融合率的研究

利用改良的HM制备液,在适宜的条件下酶解制备亲本株的原生质体,在DNase存在的条件下,用PEG(MW6,000)做为聚合剂,经低温短时间处理,将枯草杆菌(B,subtilisK)Ki—2—132衍生株与BR151衍生株的原生质体融合,再在适宜的条件下使用改良的DM_3再生培养基,补加适量经处理的人血清白蛋白,同时加入适量适合于枯草杆菌细胞壁再生的引物进行再生。使再生率达到了55—58.15％左右,融合率高达1.82×10~(-2)。筛选出51种不同类型的融合子923株。经继代八代测得其融合子的稳定率达32 46％。从而在工业菌株的选育中使获得高产菌株成为可能。     

双歧杆菌与乳杆菌原生质体的融合及筛选

目的：通过双歧杆菌与乳杆菌的原生质体融合构建耐氧双岐杆菌,以解决双岐杆菌制剂开发中始终存在的“活菌数低”和存活时间短等问题。方法：采用不同浓度的Mutanolysin分别制备长岐杆菌和保加利亚乳杆菌的原生质体,在电场作用下诱导长双岐杆菌原生质体和经56℃热灭活30min的保加利亚乳杆菌原生质体融合,并在双层再生培养基上筛选融合菌株。结果：成功地构建出几种较为稳定的兼具长双岐杆菌和保加利亚乳杆菌生物学特性的融合菌株;其中融合株F2具有良好的耐氧性;且能在有氧、CO2条件下良好生长。结论：通过原生质体融合技术能改良双歧杆菌的严格厌氧特性,有利于对双岐杆菌的开发和应用。     

荧光标记金针菇原生质体融合

以金针菇（Flmmulina velutipes）为材料,经异硫氨酸荧光素（FIC）标记的金针菇单核W19菌株的原生质体与未经标记的单核Y7菌株的原生质体在聚乙二醇（PEG）的诱导下进行融合,利用显微操纵仪直接挑取一个带有荧光而另一个不具荧光的原生质体对,培养后,根据融合形成的汉核菌丝具有“锁状连合”这一形态学特征选择、鉴定融合菌株,酯酶同工酶电泳分析结果表明,融合菌株具双亲互补酶带。经测定,多数融合菌株菌丝生长速度和生物量较亲株高,且出菇正常。     

红霉素链霉菌无活性突变株原生质体融合的研究

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株L156和生产菌株LDC2经诱变剂处理,得到了5个无活性突变株.用琼脂条法进行了共合成的互补测定,发现它们分属于3个不同类群,并初步确定了它们在红霉素合成代谢路线上发生障碍的前后顺序。我们选择了无活性突变株L156—19Em-和LDC2-4,Em-做新本,进行原生质体融合.通过溶菌酶处理时间与原生质体释放数量间关系的列比试验,不同培养基与原生质体再生频率关系的对比试验,和用琼脂块法检出融合体的试验,发现在30℃温溶中溶菌酶处理1小时即可达到最高的原生质体释放量。不同的再生培养基对于原生质体再生频率有较大影响,其中R2L培养基效果最好,其再生频率可达36％,不加特殊成份的一般斜面培养基(ZL培养基)也可以作原生质体再生,只是再生频率较低(1.2％)。用琼脂块法检出融合体是切实可行的,融合频率为1.6％。     

高产谷胱甘肽的酵母融合菌株的选育及其培养条件的研究

通过初筛、单倍体分离、诱变及原生质体融合技术选育到一株谷胱甘肽产量明显提高的融合菌株ZJF71,其谷胱甘肽产量分别为亲株的1.59和1.42倍。并对其培养条件进行了研究,结果表明碳源、装液量和培养时间对融合菌株ZJF71生产谷胱甘肽的影响较为显著。在优化的培养条件下,发酵液中谷胱甘肽总量达到185.3mg/L,为初始培养条件下的2.8倍。经遗传稳定性分析,证明融合菌株ZJF-71是遗传稳定的。