小麦TaNAC5基因克隆及表达分析

NAC转录因子在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。该研究利用RACE技术从小麦中克隆了1个NAC基因TaNAC5(HQ650113.1)。序列分析显示,TaNAC5基因开放阅读框(ORF)924bp,编码307个氨基酸。多序列比对和进化树分析显示,TaNAC5基因所编码的蛋白具有NAC家族蛋白的保守结构域,与玉米ZmNAC5有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR分析显示,TaNAC5基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、乙烯和双氧水诱导,而受高盐胁迫和ABA抑制。研究表明,TaNAC5参与非生物逆境胁迫及相关信号分子的应答。     

小麦TaMAPK2基因的克隆及表达分析

该研究从小麦中克隆了1个MAPK基因TaMAPK2。序列分析表明,TaMAPK2基因的ORF为1 110bp,编码369个氨基酸。序列比对分析表明,该基因所编码的蛋白与粗山羊草、水稻、谷子等MAPK蛋白具有较高的一致性,分别为99%、94%、94%。进化树分析表明,TaMAPK2与水稻OsMAPK2的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、乙烯和双氧水诱导,受ABA抑制。研究表明,TaMAPK2可能参与非生物逆境胁迫及相关信号分子应答。     

大豆ERF转录因子基因GmERF8的克隆与表达分析

ERF转录因子广泛存在于植物中并且参与植物应对生物及非生物胁迫的响应。本研究利用RT-PCR技术从大豆中克隆获得1个新的ERF转录因子基因Gm ERF8,开放阅读框全长627 bp,编码1个由208个氨基酸残基组成的分子量为23.43 k D的蛋白。蛋白结构预测发现,该蛋白含有1个典型的AP2/ERF结合域,2个预测的核定位信号和1个保守的EAR抑制元件。进化分析表明Gm ERF8蛋白与烟草Nt ERF3蛋白的同源性最高。实时荧光定量PCR表明,Gm ERF8在大豆的根和叶中表达量较高。ABA、高盐和低温处理均使Gm ERF8表达量下降;乙烯(ET)和干旱处理则使Gm ERF8的表达量先下降后升高。转录调节能力分析结果显示,Gm ERF8可以抑制报告基因的表达。上述实验结果表明,Gm ERF8可能作为转录抑制子参与大豆对环境胁迫的应答。     

陆地棉GhPYR1基因的克隆和功能分析

植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)在植物应对干旱、盐碱等逆境胁迫以及植物种子萌发、根伸长、芽休眠等阶段发挥重要作用。PYR/PYL/RCAR蛋白家族是ABA受体,与ABA结合后能够启动ABA信号传导通路,诱导ABA应答基因的表达。利用电子克隆和RT-PCR技术从陆地棉中克隆了Gh PYR1基因,其编码的Gh PYR1蛋白与拟南芥中At PYR1蛋白相似度为73%。将Gh PYR1蛋白序列与拟南芥14个PYR/PYL/RCAR家族成员蛋白序列进行比对并构建进化树,发现它与拟南芥PYR/PYL/RCAR蛋白亚家族III亲缘关系最近。过表达Gh PYR1基因的T3代拟南芥在外源ABA处理下,其种子萌发和初期根生长均滞后于野生型,表现出对ABA更加敏感;高盐和干旱胁迫对转基因种子的萌发抑制更强烈,但苗期胁迫处理下转基因拟南芥的长势却明显优于野生型;同时在外源ABA诱导条件下ABA应答基因RD29A、RAB18的表达量较野生型有明显提高。以上结果说明Gh PYR1基因编码的蛋白是ABA的受体,过表达该基因能够提高植物对ABA的敏感性和增强应对逆境胁迫的能力。     

木薯MeASR基因克隆及表达分析

脱落酸-胁迫-成熟诱导蛋白(Abscisic acid-stress-ripening,ASR)在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。利用PCR技术从木薯中克隆了第一个ASR基因Me ASR,序列分析表明该基因开放阅读框(ORF)330 bp,编码109个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明该基因所编码的蛋白具有ASR家族蛋白的保守结构域,与番茄ASR家族蛋白Sl ASR4具有较近的亲缘关系。亚细胞定位分析表明Me ASR定位在细胞核,实时荧光定量PCR分析表明该基因的表达显著受渗透胁迫和ABA诱导。结果表明,Me ASR可能作为转录因子参与木薯对干旱逆境胁迫应答及ABA信号调节。     

大豆C3HC4型RING锌指蛋白基因GmRZFP1克隆与表达分析

锌指蛋白在调节植物防卫基因表达和抗性反应上起关键作用。目前,对大豆中C3HC4型RING锌指蛋白基因的研究不多。本研究利用核蛋白筛选系统(NTT)筛选大豆(铁丰8号)干旱处理5h的cDNA文库,获得一个RING锌指蛋白基因。该基因全长927bp,编码308个氨基酸,含有C3HC4-type RING锌指结构域,命名为GmRZFP1。系统进化树分析显示,Gm-RZFP1属于C3HC4-type锌指亚家族。Real-time PCR结果表明,GmRZFP1基因受干旱、高盐、高温、低温、乙烯和ABA等胁迫诱导表达,表明该蛋白涉及多种胁迫相关的信号传导途径。亚细胞定位结果表明,163hGFP-GmRZFP1融合蛋白定位于细胞核中。本研究结果有助于研究该类基因在大豆逆境应答反应中的作用,阐明大豆抗逆分子机制。     

不结球白菜BcLRK01基因对芜菁花叶病毒及胁迫诱导的响应

通过cDNA-AFLP技术,从芜菁花叶病毒(TuMV)侵染的不结球白菜幼叶中分离到一条差异表达的基因片段,克隆获得其cDNA全长为2 124bp,编码707个氨基酸的富亮氨酸重复类受体激酶,命名为BcLRK01。利用实时定量PCR研究了该基因在TuMV侵染及高盐、冷胁迫、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)等处理下的表达情况,结果显示,TuMV侵染、高盐、冷胁迫、SA、JA和ET等均能诱导BcLRK01不同程度的表达,说明该基因可能是不结球白菜病毒病的病程相关基因,同时也参与高盐和冷胁迫以及SA、JA、ET等的信号途径。     

橡胶草E2泛素结合酶基因TkUBC2基因的克隆及其表达分析

为解析橡胶草E2泛素结合酶在胁迫响应和信号转导中的功能,本文从橡胶草品系1151中克隆得到一个E2泛素结合酶基因,命名为TkUBC2,该基因编码区cDNA为459 bp,编码152个氨基酸。序列比对分析发现,不同物种间的UBC2高度同源,TkUBC2与莴苣、向日葵的UBC2相似性高达99%以上。采用荧光定量qRT-PCR技术分析该基因在橡胶草中的表达模式,结果表明,TkUBC2在不同组织中均有表达;而且PEG6000模拟干旱胁迫、甘露醇介导的渗透压胁迫以及植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)和乙烯利(ET)可诱导TkUBC2下调表达;而NaCl盐胁迫和UV辐射处理则上调TkUBC2表达。结果表明TkUBC2参与橡胶草抗逆反应、激素信号转导以及DNA损伤修复过程,以上结果为进一步解析该基因的功能奠定良好的基础。     

甘蓝型油菜BnaCIPK15基因的表达分析与功能鉴定

CBL-CIPK是高等植物中广泛存在的一类解析Ca~(2+)信号的蛋白。该研究在前期工作基础上,对甘蓝型油菜(Brassica napus L.)的BnaCIPK15基因进行了亚细胞定位、双分子荧光互补(BiFC)、酵母双杂交和qRT-PCR检测等一系列分析,以探究BnaCIPK15蛋白在ABA激素响应中的作用。结果显示:(1)亚细胞定位发现,BnaCIPK15蛋白定位于细胞质和细胞核中; BiFC分析发现,BnaCIPK15蛋白与BnaCBL1/3/4/9蛋白之间的互作较强,与BnaCBL10仅有微弱互作。(2)qRT-PCR检测发现,BnaCIPK15基因受ABA和冷胁迫的诱导极显著上调表达,而对百草枯(Paraquat)、活性氧(H_2O_2)和热胁迫的诱导较弱,表明BnaCIPK15基因很可能参与ABA和冷胁迫的调控过程。(3)酵母滴定实验结果显示,BnaCIPK15蛋白与脱落酸(ABA)信号通路中的BnaHAB1蛋白(属于蛋白磷酸酶PP2C家族)存在明显的互作,而与BnaABFs/AREB3/ABI5转录因子无明显互作;BiFC验证显示,BnaCIPK15与BnaHAB1蛋白之间存在互作信号,而BnaCIPK15与BnaHAB2组合没有观察到信号,证明BnaCIPK15与BnaHAB1磷酸酶具有特异互作特征,推测BnaCIPK15可能参与调控ABA信号转导。研究认为,甘蓝型油菜中可能存在基于BnaCIPK15-BnaHAB1的互作模块,并参与ABA的信号转导和网络调控。     

香鳞毛蕨DfDREB基因克隆与表达模式分析

DREB(dehydration-responsive element-binding)转录因子是响应非生物胁迫反应的主要调节因子,为探索DREB在多年生草本药用植物香鳞毛蕨[Dryopteris fragrans(L.) Schott]抗逆过程中的功能,该研究克隆了DfDREB基因并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR方法分析了DfDREB基因在不同激素及干旱、NaCl、高温和低温等逆境胁迫处理下的表达模式。结果表明:(1)成功获得DfDREB基因全长1 203 bp,其编码401个氨基酸,相对分子质量为43.66 kD,等电点为6.13,是亲水性非分泌蛋白,该蛋白具有AP2保守结构域,属于AP2家族。(2)实时荧光定量PCR分析表明,DfDREB基因在香鳞毛蕨根、叶柄和叶中均有表达,其中在叶中表达量最高,根中表达量最低;在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(ETH)处理时,DfDREB基因表达上调,并都在1 h时表达量达到峰值;在脱落酸(ABA)处理时,DfDREB基因的相对表达量仅在12 h和24 h时呈上调表达,其余时间为下调表达;在干旱、NaCl和高温处理时,DfDREB基因表达均上调;低温处理0.5 h和12 h时DfDREB基因表达显著上调,但在低温处理1～6 h和24 h时无明显变化。研究表明,DfDREB基因响应激素和非生物胁迫处理,且基因表达受胁迫诱导。该研究结果为进一步探索香鳞毛蕨抗逆分子机制奠定了基础。     

丹参SmPI1和SmPI2基因克隆及胁迫表达研究

该研究从药用植物丹参中克隆了SmPI1和SmPI2蛋白酶抑制剂基因,采用生物信息学和实时荧光定量PCR方法对其序列及表达模式进行了分析。序列分析结果表明,丹参SmPI1和SmPI2基因分别含有一个长度为222bp和216bp的开放阅读框,编码73和71个氨基酸;2个编码蛋白都无跨膜结构域和信号肽,预测都定位于细胞质中;SmPI1和SmPI2蛋白与川桑、可可、苜蓿等植物的蛋白酶抑制剂基因相似性较高,分别为58%、52%、53%和54%、56%、51%。实时荧光定量PCR结果表明,SmPI1和SmPI2基因受茉莉酸甲酯(MeJA)和甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris,XC)显著诱导,说明丹参SmPI1和SmPI2基因可强烈响应这两类胁迫,可能参与丹参中两类胁迫分子途径相关的抗性反应。     

厚藤脱水素基因IpDHN启动子IpDHN-Pro的克隆和调控转录活性分析

为了解厚藤(Ipomoea pes-caprae)脱水素基因IpDHN (GenBank登录号:KX426069)启动子的转录活性和对非生物胁迫和植物激素ABA的响应,通过染色体步移法克隆了IpDHN的上游启动子序列IpDHN-Pro,长度为974 bp。构建IpDHN-Pro调控下GUS转基因载体,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株获得IpDHN-Pro::GUS转基因植株并进行GUS染色,验证IpDHN-Pro启动转录活性以及在氯化钠、甘露醇、ABA处理后拟南芥GUS基因表达变化。结果表明,扩增获得的IpDHN-Pro序列包含多个顺式作用元件,包括1个ABRE、3个Myb转录因子结合位点、富含TC的重复序列以及Skn-1基序等。转基因拟南芥GUS染色及qRT-PCR表明该序列可驱动GUS基因在拟南芥稳定表达,且表达受高盐、渗透压及ABA的诱导。这表明IpDHN-Pro是一个盐旱、ABA诱导的启动子序列,可应用于相关的植物抗逆遗传工程研究。     

拟南芥类受体蛋白激酶基因CRK45对外源钙离子的响应

以拟南芥野生型和类受体蛋白激酶基因CRK45的T-DNA插入突变体crk45为材料,采用差异基因表达筛选技术检测ABA处理后野生型和crk45中基因表达的差异。结果显示:(1)crk45突变体中有1个基因的表达比野生型高约4倍。(2)NCBI数据库检索表明,该基因编码的蛋白具有EF手型结构,蛋白序列全长为130个氨基酸,是典型的Ca2+结合蛋白,故命名为CRK45抑制的钙离子结合蛋白(CICBP)。(3)Northern blotting分析结果显示,ABA处理后crk45突变体中CICBP的表达明显升高,证明CICBP基因的确受ABA诱导,且其表达受CRK45的抑制。(4)外源75mmol/L的Ca2+处理后,crk45突变体的萌发率(30.8%)显著高于野生型(17.16%),说明在Ca2+介导下CRK45的功能是抑制种子萌发。(5)qRT-PCR检测显示,野生型中CRK45的表达受Ca2+诱导明显升高,而crk45突变体中的表达一直保持很低,说明crk45突变体是一个基因敲除突变体;Ca2+处理后crk45突变体中CICBP基因表达上调,而野生型中CICBP的表达反而降低,说明Ca2+处理下CRK45抑制CICBP基因的表达。研究表明,ABA或Ca2+处理后,CRK45通过负调控CICBP基因的表达,从而抑制拟南芥种子萌发。     

旱麦草EtAP2基因的克隆及其对干旱胁迫的响应表达

以旱麦草(Eremopyrum triticeum)为实验材料,利用RT-PCR技术从旱麦草叶片中克隆了1个AP2/ERF家族基因,命名为EtAP2(GenBank登录号KX622583)。EtAP2基因含有1 128bp开放阅读框,编码375个氨基酸,相对分子质量40.87kD,等电点为5.36。多序列比对和进化树分析表明,该基因编码蛋白具有2个AP2保守结构域,与小麦AP2/ERF家族蛋白具有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR分析表明,15%PEG 6000模拟干旱胁迫可诱导EtAP2基因在根和叶中表达,且在根中对干旱胁迫的响应大于叶片。研究表明,EtAP2可能参与旱麦草对干旱逆境胁迫应答的调节。     

AP2/ERF转录因子调控植物非生物胁迫响应研究进展

低温、干旱、高盐和缺氧等多种不良环境影响植物的生长发育, 植物通过长期进化形成复杂的调节机制来适应这些不利条件。AP2/ERF是植物特有的转录因子, 在各种胁迫响应过程中发挥关键调控作用。近年来, 越来越多的研究表明, 植物激素介导的信号级联通路与逆境胁迫响应关系密切, AP2/ERF转录因子可与激素信号转导协同形成交叉调控网络。许多AP2/ERF转录因子通过响应植物激素脱落酸和乙烯, 激活依赖或不依赖于脱落酸和乙烯的胁迫响应基因的表达。此外, AP2/ERF转录因子参与赤霉素、细胞分裂素和油菜素内酯介导的生长发育和胁迫应答。该文简要综述了AP2/ERF转录因子的结构特征、转录调控、翻译后修饰、结合位点、协同互作蛋白及其参与调控依赖或不依赖激素信号转导途径的非生物胁迫响应研究进展, 为解析不同AP2/ERF转录因子在调控激素和胁迫响应网络中的作用提供理论依据。     

雷公藤AP2/ERF转录因子基因的克隆与分析

该研究以雷公藤发状根为材料,根据雷公藤根转录组数据设计引物,采用RT-PCR方法克隆得到2个雷公藤AP2/ERF转录因子,分别命名为TwAP2/ERF1基因(GenBank登录号:GAVZ01042389.1)和TwAP2/ERF2基因(GenBank登录号:GAVZ01016765.1)。TwAP2/ERF1基因含有一个525bp开放阅读框(ORF),编码186个氨基酸;TwAP2/ERF2基因的ORF为789bp,编码262个氨基酸;2个基因编码的蛋白质均为亲水性蛋白质。系统进化分析表明,TwAP2/ERF1与油桐(Vernicia fordii)AP2/ERF(APQ47444.1)和木油桐(Vernicia montana)AP2/ERF(APQ47365.1)相似性较高,TwAP2/ERF2与毛果杨(Populus trichocarpa)AP2/ERF(XP_002304640.1)和樱桃(Prunus pseudocerasus)AP2/ERF(ALD84477.1)相似性较高。雷公藤发状根经MeJA诱导后,TwAP2/ERF1基因的相对表达量明显提高,并于处理后9h达到最高值,为对照表达量的16.77倍;而MeJA处理对TwAP2/ERF2基因的表达表现出抑制作用,但于处理后48h相对表达量有所提高。研究表明,雷公藤TwAP2/ERF1转录因子响应MeJA早期诱导正调控,推测其可能参与调控雷公藤植物次生代谢产物的生物合成,该研究结果为阐明雷公藤次生代谢物质的生物合成调控与利用现代生物技术提高雷公藤植物细胞中次生代谢物质的含量奠定了基础。     

丹参SmVS基因的克隆和表达分析

为了解丹参(Salvia miltiorrhiza)的Vinorine合成酶基因(VS)的功能,从丹参中克隆了SmVS基因,并通过Ex PASy等在线分析软件对其进行生物信息学分析,同时利用RT-qPCR技术分析其表达模式。结果表明,SmVS基因全长726 bp,编码241个氨基酸,编码蛋白分子量为26 861.72,等电点PI为5.66,为膜外蛋白,推测定位于线粒体。系统进化分析表明,丹参SmVS与野生油橄榄(Olea europaea var. sylvestris)的VS亲缘关系较近。SmVS基因在丹参根中的表达比叶的高,叶中的转录水平在21:00最高。因此,推测SmVS基因与光应答有关。     

青杄转录因子PwNAC30及其启动子序列的克隆与表达分析

该研究以青杄(Picea wilsonii)为实验材料,通过PCR从青杄的cDNA文库中克隆得到一个NAC转录因子,命名为PwNAC30。生物信息学分析显示,PwNAC30开放阅读框1 179bp,共编码392个氨基酸,在其N端存在保守的NAM(no apical meristem)结构域,可分为A～E等5个亚结构域。多序列对比和系统进化树分析显示,PwNAC30蛋白与同为云杉属的北美云杉(Picea sitchensis)聚为一类。启动子克隆分析显示,PwNAC30基因启动子上存在脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、TC-rich repeats等激素和逆境响应元件,在GA、ABA、MeJA、低温、干旱、盐的处理下,其启动子活性均明显增强。荧光定量PCR分析表明,PwNAC30在球果中的表达量最高,而在花粉和种子中的表达量最低。PwNAC30对于盐、干旱、低温、ABA、MeJA、GA处理均有响应,尤其对盐、干旱、MeJA的响应最为显著。亚细胞定位结果显示,PwNAC30蛋白定位于细胞核与细胞质,主要定位于细胞核中。酵母单杂及双杂结果表明,PwNAC30蛋白的全长和N端没有转录激活活性,而C端有转录激活活性,且PwNAC30自身能形成同源二聚体。研究表明,青杄PwNAC30基因可以作为一个转录因子发挥作用,其转录激活活性在C端,且自身能够形成同源二聚体结构;PwNAC30基因广泛参与了ABA、GA、MeJA等激素的信号通路,并对盐、干旱、低温处理有响应。     

OsCOI1，水稻中一个受茉莉酸甲酯和脱落酸诱导表达的F-box家族基因

利用Blast检索、EST分析和RT-PCR, 在水稻中分离到一个与拟南芥COI1同源的新基因,命名为OsCOI1. OsCOI1编码595个氨基酸. 推测的OsCOI1编码蛋白有一个F-box motif和16个富含亮氨酸的重复序列,这与拟南芥COI1相似. OsCOI1在氨基酸水平上和COI1有很高的同源性(74%). 经半定量RT-PCR法和RNA印迹分析,表明水稻中OsCOI1表达水平在经茉莉酸甲酯和脱落酸处理后呈明显变化,但不受水杨酸和乙烯的影响,说明OsCOI1可能在茉莉酸信号途径和脱落酸途径中具有特定功能.     

Abscisic acid regulates TSRF1-mediated resistance to Ralstonia solanacearum by modifying the expression of GCC box-containing genes in tobacco

Although recent studies have established a significant regulatoryrole for abscisic acid (ABA) and ethylene response factor (ERF)proteins in plant pathogen resistance, it is not clear whetherand how ABA performs this role. Previously, it was reportedthat an ERF protein, TSRF1, activates the expression of GCCbox-containing genes and significantly enhances the resistanceto Ralstonia solanacearum in both tobacco and tomato plants.Here, it is reported that TSRF1-regulated pathogen resistanceis modified by ABA application. TSRF1 activates the expressionof ABA biosynthesis-related genes, resulting in the increaseof ABA biosynthesis, which further stimulates ethylene production.More interestingly, ABA application decreases, while the inhibitorof ABA biosynthesis fluridone increases, the TSRF1-enhancedresistance to R. solanacearum. This observation is further supportedby the finding that ABA and fluridone reversibly modify theability of TSRF1 to bind the ethylene-responsive GCC box, consequentlyaltering the expression of element-controlled genes. These resultstherefore establish that TSRF1-regulated resistance to R. solanacearumcan be modified in tobacco by ABA. Key words: Abscisic acid, ERF protein TSRF1, GCC box-containing genes, Ralstonia solanacearum, tobacco