甘蓝型油菜钙依赖蛋白激酶6(BnaCPK6)的定位与互作蛋白分析

为了探究甘蓝型油菜中钙依赖蛋白激酶(calcium dependent protein kinase, CPK)在植物对逆境响应中的作用和机制,同时为油菜品质的升级改良发掘新的基因资源,开展了对于BnaCPK6研究的分子生物学试验。首先,通过在本氏烟草中瞬时表达BnaCPK6与GFP融合蛋白来检测它的亚细胞定位情况;其次,利用双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation)试验来检测BnaCPK6与ABA信号通路中转录因子BanABF1/3/4、BnaABI5、BnaAREB3的相互作用情况。结果显示BnaCPK6具有典型的钙依赖蛋白激酶特征,N端具有潜在的棕榈酰化和豆蔻酰化位点,并且与AtCPK6在进化上有着很高的同源性。亚细胞定位的结果发现BnaCPK6主要分布于细胞膜和细胞核中。同时,双分子荧光互补试验还发现BnaCPK6与调控ABA信号转导的关键转录因子BnaABF3/4、BnaABI5以及BnaAREB3之间存在相互作用。本研究为进一步研究BnaCPK6在ABA信号通路中的作用提供了依据。     

甘蓝型油菜BnaCIPK15基因的表达分析与功能鉴定

CBL-CIPK是高等植物中广泛存在的一类解析Ca~(2+)信号的蛋白。该研究在前期工作基础上,对甘蓝型油菜(Brassica napus L.)的BnaCIPK15基因进行了亚细胞定位、双分子荧光互补(BiFC)、酵母双杂交和qRT-PCR检测等一系列分析,以探究BnaCIPK15蛋白在ABA激素响应中的作用。结果显示:(1)亚细胞定位发现,BnaCIPK15蛋白定位于细胞质和细胞核中; BiFC分析发现,BnaCIPK15蛋白与BnaCBL1/3/4/9蛋白之间的互作较强,与BnaCBL10仅有微弱互作。(2)qRT-PCR检测发现,BnaCIPK15基因受ABA和冷胁迫的诱导极显著上调表达,而对百草枯(Paraquat)、活性氧(H_2O_2)和热胁迫的诱导较弱,表明BnaCIPK15基因很可能参与ABA和冷胁迫的调控过程。(3)酵母滴定实验结果显示,BnaCIPK15蛋白与脱落酸(ABA)信号通路中的BnaHAB1蛋白(属于蛋白磷酸酶PP2C家族)存在明显的互作,而与BnaABFs/AREB3/ABI5转录因子无明显互作;BiFC验证显示,BnaCIPK15与BnaHAB1蛋白之间存在互作信号,而BnaCIPK15与BnaHAB2组合没有观察到信号,证明BnaCIPK15与BnaHAB1磷酸酶具有特异互作特征,推测BnaCIPK15可能参与调控ABA信号转导。研究认为,甘蓝型油菜中可能存在基于BnaCIPK15-BnaHAB1的互作模块,并参与ABA的信号转导和网络调控。