谷子、大麦、高粱抗黄矮病候选基因的生物信息学比较分析

黄矮病是禾本类作物的主要病害之一,该病主要由大麦黄矮病毒侵染所致,侵染该病毒后植株生理活动紊乱,叶片黄化至红化,结实率低,严重影响农作物的产量。大麦黄矮病毒最早发现于大麦作物中,对大麦抗黄矮病的研究较早,但至今仍未从大麦克隆到黄矮病抗病基因。利用病毒诱导基因沉默系统和转基因技术,TIRB基因被验证具有抗黄矮病功能,是小麦抗黄矮病的关键基因。我们通过用小麦TIRB基因序列,在谷子、高粱和大麦基因库进行BLAST比对,发掘了谷子、高粱和大麦抗黄矮病候选基因,并运用生物信息学软件,分析、比较了这些基因所表达蛋白的理化性质,蛋白的亲疏水性及亚细胞定位,信号肽预测及三级结构等。不同物种中的这些蛋白相似的性质暗示着它们可能执行相近的抗病机制。总之,三种候选基因的发现,对于通过生物信息手段发掘作物抗病基因具有一定的指导意义。     

扁蓿豆冷诱导基因差异表达分析

以直立型扁蓿豆幼苗为试验材料,采用cDNA-AFLP技术分析扁蓿豆在低温胁迫诱导下的基因表达差异.结果显示,利用筛选的64对引物组合,对0℃低温处理3～5叶期扁蓿豆幼苗的叶片cDNA进行扩增,共获得549条差异表达的转录衍生片段(TDFs).选取上调表达较好的43条片段进行克隆、测序、Blastx比对和功能分析,其中32个TDFs的蛋白序列与基础代谢、信号转导、转录因子、防御等功能有关,11个TDFs为假设蛋白、未知蛋白或没有找到一致序列.利用荧光定量PCR对3种不同上调表达差异片段进行验证,结果可从数值上更准确地显示差异片段在低温胁迫过程中的相对表达量.     

显性核不育亚麻可育、不育花蕾mRNA差异表达研究及差异片段分析

利用mRNA差异显示技术,以显性雄性核不育亚麻不育系分离出的可育株和不育株为材料,对可育、不育花蕾中基因差异性表达进行了研究.对回收的差异片段进行反向Northern杂交验证,获得了7个阳性差异表达基因片段,并对它们进行测序和BLAST分析,最后确定了3个候选基因片段G-E07-100、G-E07-830和G-E07-330.序列分析结果表明:G-E07-100与蓖麻(Ricinus communis)的GTP-结合蛋白基因部分序列高度(90%)同源;G-E07-830与梨(Pyrus pyrifolia)的β-木糖苷酶基因高度同源(80%),并且还包含1个糖基水解酶家族C-末端的保守结构域;G-E07-330与亚麻(Linum usitatissimum)LuP12025D10 cDNA高度(89%)同源.进一步的Northern杂交结果表明3个候选基因均在不育花蕾中表达.     

抗病基因Bdv2抑制大麦黄矮病毒复制和运动的分子证据

小麦-中间偃麦草易位系YW642含有一个源于中间偃麦草7X染色体的抗性基因Bdv2,对大麦黄矮病毒GAV株系具有高度抗性。为有效控制该病毒和阐明抗黄矮病机制,采用半定量RT-PCR的方法,研究了大麦黄矮病毒GAV株系在YW642及其感病姊妹系YW641中积累浓度的差异。分别在接种病毒不同时间、不同部位上取样,用半定量RT-PCR的方法来检测GAV的积累浓度。在接种部位,抗病植株中病毒的浓度远远低于感病植株。在侵染的前5d,抗病植株YW642中病毒会有一定程度的复制和积累,但随后病毒浓度开始下降,接种14—16d时没有检测到病毒;而在感病株系中,病毒积累的浓度远远高于抗病植株,并一直维持一个较高的浓度。在未接种部位．感病植株中可检测到较高浓度的病毒,说明病毒能从接种点很快运动到未接种部位,并大量复制。而在抗病系YW642中,未接种部位始终未检测到病毒。实验结果从分子水平上证明,在抗病植株中BYDV的复制和运动均受到了极大的抑制：这是抗病基因Bdv2与BYDV互作后,激活了一系列防御基因的结果。另外还确定了防御基因诱导表达的时间,为从抗病植株中分离抗病相关基因、研究抗黄矮病机制提供了取样的依据。     

用分子标记定位源于中间偃麦草的小麦抗黄矮病基因

利用生物素标记的中间偃麦草基因组总DNA作为探针 ,对以L1为抗源的抗黄矮病小麦新品系H960 642的有丝分裂中期染色体进行原位杂交 ,结果表明 :H960 642是纯合的小麦 中间偃麦草易位系 ,携有抗黄矮病基因的中间偃麦草染色体片段易位到小麦染色体端部 .采用小麦第 7部分同源群上的 8个RFLP探针进行Southern分析 ,结果表明 :H960 642的小麦 7D染色体长臂末端片段被中间偃麦草染色体 7X长臂末端片段所取代 ,即该染色体为T7DS·7DL -7XL ,易位断点位于Xpsr680和Xpsr965之间 ,距着丝点的遗传距离约 90～ 99cM .筛选出了与 7X上抗黄矮病基因紧密连锁的RFLP标记psr680和psr687.将该抗黄矮病基因定位于 7XL端部、RFLP遗传图Xpsr680与Xpsr687位点附近 .Ep 1同工酶分析结果佐证了RFLP分析结果 .     

cDNA-AFLP和cDNA-SRAP技术在植物基因差异表达上的应用及其分析比较

对cDNA-AFLP和cDNA-SRAP技术在植物上的应用研究进行了介绍,指出cDNA-AFLP和cDNA-SRAP技术已逐渐成为基因表达研究的重要工具,是构建转录图谱、定位目标性状位点、研究差异基因表达等研究的主要手段,具有广泛广阔的应用前景.但是cDNA-AFLP和cDNA-SRAP技术均具有一定的缺限,主要表现在获得的差异片段还不够全面丰富.cDNA-AFLP可以扩增到扩增较多的带,但试验程序比较繁琐、昂贵而且耗时较长、操作较困难;而cDNA-SRAP相对比较简便、便宜而耗时较短,较易操作.因而将cDNA-AFLP与cDNA-SRAP技术结合起来,可望得到更全面丰富的差异片段,从而在植物基因差异表达、新基因发现、抗逆性分子机理研究等方面发挥更大的作用.     

利用单酶切cDNA—AFLP技术分离玉米对生性状相关基因差异表达片段

为了深入地研究对生玉米这一珍贵的高产育种种质资源和植物形态发育突变材料形成的分子机理和调控机制,通过构建合适的玉米对生、互生近等基因系总RNA池,首次采用改进的单酶切cDNA-AFLP技术,对扩增的玉米对生性状相关基因的差异表达片段进行筛选、分离和生物信息学分析.结果共获得29条差异表达片段:对生玉米增强表达23条、抑制表达6条.选取其中5条(STT-TT、STT-TC、STT-CC、STT-GC、SCT-TG)增强表达片段进行克隆和测序,序列同源性分析表明:STT-GC与烟草细胞色素b5基因有80%的同源性、SCT-TC与玉米、牛筋草、大麦、狗尾草、水稻等的α-微管蛋白基因有90%以上的同源性.实验证明:单酶切cDNA-AFLP技术是一种研究玉米基因差异表达的实用方法.     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38抗病相关基因片段的分离

利用差异显示技术,分析小麦TcLr38受小麦叶锈菌诱导的mRNA表达丰度差异,获得了136条差异条带。对136条差异条带进行了回收、重扩增和反向Northern杂交检测,获得一条杂交信号阳性的片段,对该片段进行克隆、测序,该片段长度为425bp。在GenBank中进行Blast比对分析,与普通小麦(Triticum aestivum)同源性较高,并且与小麦抗盐cDNA序列也有较高的同源性;在GrainGenes中进行Blast比对,与小麦的远源亲本粗山羊草(Aegilops tauschii)、栽培一粒小麦(T.monococ-cum)和普通小麦具有较高同源性。利用SegMan软件进行电子克隆延长该片段,未找到与其相符的重叠群。因此确定该片段为TcLr38的cDNA片段,并初步推测该片段可能为一小麦抗病相关基因片段。     

玉米对二氧化硫胁迫响应的相关cDNA克隆与分析

应用mRNA差异显示技术,对高耐SO2玉米自交系Q9进行了SO2胁迫下的基因差异表达分析.结果显示,30对引物组合进行的PCR扩增中,获得了13条差异表达的cDNA片段,其中3条诱导表达,2条增强表达,6条减量表达,2条抑制表达.序列分析和数据库比对表明,GenBank中只搜寻到5条cDNA序列,其中2条增强表达的cDNA片段D1和D5分别与氨基酸结合蛋白ABP、锌指结构转录因子蛋白DOF部分序列高度同源,其他诱导表达的3条cDNA(D3、D6、D11)功能未知,可能是新的cDNA片段.经半定量RT-PCR分析验证,D1和D5转录水平受SO2胁迫表达显著增强,推测D1和D5可能参与了玉米对SO2胁迫的抗性反应.     

应用原位杂交及RAPD技术标记抗黄矮病小麦—中间偃麦草染色体异附加系

以生物素标记中间偃麦草基因组ＤＮＡ为探针,与抗黄矮病小麦－中间偃麦草染色体异附加系Ｚ６进行原位杂交,鉴定出附加的１对中间偃麦草染色体。对异附加系Ｚ６和Ｌ１及它们的小麦亲本进行了ＲＡＰＤ分析,从１２０个随机引物中,筛选出２个引物可以扩增出附加染色体的特异ＤＮＡ片段,可作为鉴定导入小麦的中间偃麦草染色质的分子标记。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.