华癸根瘤菌7653R hfq基因突变株的构建及其生物学特性

【目的】研究hfq基因在Mesorhizobium huakuii 7653R抵抗外界不利环境和共生固氮中的功能特性。【方法】利用pK19mob同源重组方法构建7653R hfq基因的插入失活突变株7653RΔhfq,并构建互补菌株7653RΔhfq-C,对hfq在压力胁迫和共生固氮中的功能特性进行研究。【结果】与野生型7653R相比,突变株7653RΔhfq的生长速率降低,热激处理后致死率升高;hfq突变影响了7653R中部分sRNA的表达;在4.5%乙醇和50 mmol H_2O_2生长胁迫下,突变株适应性明显较野生型差。另外,接种突变株的紫云英结瘤能力和固氮酶活性都明显降低。【结论】hfq基因作为重要的转录后调控因子,在7653R抵御外界胁迫环境和与宿主紫云英的共生固氮中发挥了重要作用。     

华癸中慢生根瘤菌7653R 3个脂质转运蛋白基因的克隆、突变及共生表型北大核心CSCD

【目的】脂类转移家族蛋白基因编码一类参与脂类转运及代谢的蛋白。本研究旨在构建华癸中慢生根瘤菌3个脂质转运家族蛋白基因的突变株,检测及分析突变体与紫云英共生条件下的表型及功能。【方法】利用生物信息学分析与预测转脂蛋白的结构特征及功能,采用荧光定量技术检测目标基因在自生和共生条件下的表达特性,通过插入突变技术构建目标基因突变株,并进行植物盆栽实验考察其共生表型。【结果】MCHK-5577、MCHK-2172和MCHK-2779基因编码蛋白属于START/RHO alpha_C/PITP/Bet_v1/Cox G/Cal C(SRPBCC)超家族,包含脂类转移结构域,参与脂类转运或代谢,与百脉根等中慢生根瘤菌相应基因的序列相似性达95%以上。这3个基因在共生条件下的表达水平都增高。分别构建了MCHK-5577、MCHK-2172和MCHK-2779基因突变菌株,与野生型菌株7653R相比,接种突变株MCHK-2172mut、MCHK-2779mut和MCHK-5577mut后的植株地上部分生物量和根瘤固氮酶活性显著降低。【结论】华癸中慢生根瘤菌脂质转移家族蛋白基因在共生互作过程中发挥重要作用,突变后明显影响共生固氮表型。本文的实验结果为深入研究脂类转移蛋白在共生固氮作用中的功能机制奠定了基础。     

华癸根瘤菌外膜孔蛋白编码基因MCHK_1326突变株的构建与共生固氮表型分析

【目的】Mesorhizobium huakuii 7653R的MCHK_1326基因编码一种外膜孔蛋白,可能参与根瘤菌侵染宿主植物以及结瘤固氮过程,本研究旨在探索该基因在共生固氮中的功能。【方法】生物信息学分析MCHK_1326蛋白的结构特征及生物学功能,启动子原位表达技术检测MCHK_1326共生时空表达特征,利用Cre-loxp系统构建MCHK_1326缺失突变株,考察其共生固氮表型及早期侵染事件,通过植物盆栽并额外添加无机氮源,检测突变株接种紫云英后的共生固氮表型变化。【结果】MCHK_1326基因在侵染早期如侵染线的延伸等过程中表达,在成熟根瘤的侵染区表达,与野生型相比,突变体△1326侵染线和根瘤原基数量显著减少;植株地上部分鲜重与固氮酶活性极显著降低,根瘤数量和根瘤重量显著降低;额外添加无机氮源能恢复其共生缺陷表型。【结论】MCHK_1326基因参与根瘤菌早期侵染和结瘤,在根瘤发育与共生固氮过程中发挥作用。     

华癸根瘤菌urtB基因突变株的构建与共生固氮表型分析

【目的】尿素ABC转运体透性酶亚基编码基因urtB可能参与尿素代谢及支链氨基酸转运;本文旨在获得实验证据阐明urtB基因对华癸根瘤菌结瘤和固氮的影响,为深入研究其功能机制提供一定的科学依据。【方法】利用生物信息学分析urtB基因的结构特征及生物学功能,通过荧光定量检测urtB基因在自生和共生条件下的时空表达特征和启动子原位表达技术检测urtB基因组织表达特征,采用插入突变构建urtB突变株,通过植物盆栽并结合添加氮素处理,检测与分析突变体的共生固氮表型变化。【结果】分析表明urtB基因对于氮素转运非常重要,在共生条件下的表达水平比自生培养条件下显著上调表达;在成熟根瘤的固氮区中大量表达;正确构建和筛选获得了根瘤菌urtB突变株;接种urtB突变株与野生型菌株7653R相比较,突变体根瘤发育异常;植株地上部分生物量和根瘤固氮酶活性显著降低;添加氮素可恢复其共生缺陷表型。【结论】华癸中慢生根瘤菌urtB基因可能通过影响根瘤中氮转运或同化,进而在根瘤发育与共生固氮中发挥重要作用。     

大豆快生根瘤菌SMH12效应蛋白NopP在共生固氮过程中的功能

【目的】研究Sinorhizobium fredii SMH12中的nopP在共生固氮过程中的功能,为深入解析根瘤菌效应蛋白的菌植互作机理提供线索,进而为大豆高效根瘤菌的遗传改良提供一定的科学依据。【方法】利用生物信息学分析nopP的结构特征,构建nopP缺失、过表达和互补菌株,并对其进行共生表型分析;通过qRT-PCR分析nopP在共生过程中的时空表达特征,测定在接野生型和突变体的冀豆17中NIN、ENOD40、PR1、PR2和PR5的表达量;采用激光共聚焦显微镜观察NopP的亚细胞定位。【结果】根瘤菌的NopP不包含任何已知功能域,与病原体的任何Avr效应物没有同源性。nopP缺失之后对冀豆17和中黄13的根瘤固氮酶活均有显著影响,在瘤数上对冀豆17有显著增加,表明nopP突变后促进其与冀豆17和中黄13的共生固氮。qRT-PCR显示,nopP在自生条件下少量表达,在共生条件下表达量显著升高,尤其在接菌2 d后表达量达到最高,显示该基因可能与根瘤菌早期侵染相关。此外,发现NopP在烟草叶片和大豆根中均定位于细胞膜和细胞核。接种突变体的冀豆17根中NIN的表达量升高1.2倍,PR5的表达量降低3.6倍。【结论】效应蛋白NopP在与大豆共生过程中,参与根瘤菌的早期侵染以及在根瘤菌与豆科宿主植物之间的免疫防御反应中发挥重要功能。     

花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MM6 Ⅲ型分泌系统的结构和功能

【目的】探究花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MM6的Ⅲ型分泌系统(T3SS)的结构及其在根瘤菌与不同宿主建立共生关系中的作用。【方法】同源比对分析菌株MM6的T3SS基因簇的结构特征,并采用三亲本接合转移的方法构建T3SS调节基因ttsI突变菌株;通过蛭石结瘤和石蜡切片实验,比较突变体与野生型的共生固氮表型差异。【结果】经预测,MM6的T3SS基因簇编码区长约34.1 kb,可分为3个区域,包含10个保守结构基因和8个效应蛋白基因,与B.diazoefficiens USDA110相应基因的序列相似性为83%–93%;成功构建了MM6的ttsI突变株;ttsI突变株与野生型分别与花生(S523和Y45)、野大豆和大豆中黄57结瘤,ttsI突变体在花生中的总瘤数显著增加(P<0.05),根瘤中含菌细胞更多;ttsI突变体在野大豆中平均每株植物增加4个根瘤,根瘤中含菌细胞更多,地上部干重相比野生型MM6显著增加(P<0.05);在大豆中黄57中,野生型MM6能形成红色的有效根瘤,ttsI突变体不结瘤,且植株叶片发黄,地上部干重相比野生型MM6显著降低(P<0.05)。【结论】MM6的T3SS在花生和野大豆共生体系中起着有害的作用,而在大豆中黄57的共生体系中起着有利的作用。     

花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MM6 Ⅲ型分泌系统的结构和功能

【目的】探究花生根瘤菌Bradyrhizobium sp. MM6的Ⅲ型分泌系统(T3SS)的结构及其在根瘤菌与不同宿主建立共生关系中的作用。【方法】同源比对分析菌株MM6的T3SS基因簇的结构特征,并采用三亲本接合转移的方法构建T3SS调节基因ttsI突变菌株;通过蛭石结瘤和石蜡切片实验,比较突变体与野生型的共生固氮表型差异。【结果】经预测,MM6的T3SS基因簇编码区长约34.1 kb,可分为3个区域,包含10个保守结构基因和8个效应蛋白基因,与B. diazoefficiens USDA110相应基因的序列相似性为83%–93%;成功构建了MM6的ttsI突变株;ttsI突变株与野生型分别与花生(S523和Y45)、野大豆和大豆中黄57结瘤,ttsI突变体在花生中的总瘤数显著增加(P0.05),根瘤中含菌细胞更多;ttsI突变体在野大豆中平均每株植物增加4个根瘤,根瘤中含菌细胞更多,地上部干重相比野生型MM6显著增加(P0.05);在大豆中黄57中,野生型MM6能形成红色的有效根瘤,ttsI突变体不结瘤,且植株叶片发黄,地上部干重相比野生型MM6显著降低(P0.05)。【结论】MM6的T3SS在花生和野大豆共生体系中起着有害的作用,而在大豆中黄57的共生体系中起着有利的作用。     

苹果树腐烂病菌非核糖体多肽合成酶基因VmNRPS12的功能

【目的】非核糖体多肽合成酶(NRPS)在植物病原真菌与其寄主互作过程中发挥着重要作用,明确Vm NRPS12基因在苹果树腐烂病菌致病过程中的功能,将为今后深入研究苹果树腐烂病菌NRPS作用机制提供理论依据。【方法】基于苹果树腐烂病菌全基因组数据,得到VmNRPS12基因。运用qRT-PCR技术分析VmNRPS12在侵染初期的表达水平,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化获得该基因抗潮霉素的突变体,对突变体进行PCR检测及Southern blot验证得到敲除突变体,进一步通过重新导入该基因全长片段获得互补突变体,最后对野生型、敲除突变体和互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】定量分析显示该基因在侵染初期显著上调表达,且接种48 h后的表达量是对照的138.6倍。该基因的敲除突变体在营养生长及产孢方面与野生型菌株03-8相比无显著性差异,但致病力与野生型菌株03-8相比显著减弱,且互补突变体致病力近似恢复至野生型水平。【结论】VmNRPS12基因与苹果树腐烂病菌致病性相关。     

水稻条斑病菌pilT基因在致病性中的功能分析

【目的】本实验室前期研究发现水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)RS105菌株中pil T基因Tn5转座子插入突变体在寄主水稻上致病性明显降低,在非寄主烟草上激发过敏反应(hypersensitive response,HR)的能力也明显减弱。为了揭示pilT基因在Xoc菌株中的功能,本文进行了深入研究。【方法】本实验通过无标记双交换敲除的方法获得Xoc RS105菌株pil T基因缺失突变体RΔpilT,并对该突变体的游动性以及生物膜等表型进行了检测。【结果】与野生型RS105菌株相比,敲除突变体RΔpilT不仅在感病水稻IR24上的致病性显著降低,在非寄主烟草上产生过敏反应的能力减弱,而且突变体游动性降低,生物膜含量增加,互补子能够恢复上述缺陷至野生型水平。qRT-PCR结果显示,在RΔpil T中,hrpG、hrpX、hrcC、clp、rpfG、pilA、pilC基因表达量明显降低。【结论】Xoc中pilT为重要的毒性相关基因,其致病性与游动性和生物膜含量变化相关,并且受clp、rpfG、pilA、pilC等基因调控。pil T基因编码的Pil T蛋白是构成IV型菌毛的亚基之一,为菌体运动提供能量。本文对pilT基因的功能研究,为进一步分析IV型菌毛在Xoc中的功能提供了线索。     

茎瘤固氮根瘤菌ORS571鞭毛马达基因fliN与fliM的功能分析

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌ORS571中鞭毛马达蛋白FliN、FliM的编码基因分别缺失的突变体表型,初步探究其功能机理。【方法】本研究采用同源重组和三亲本接合转移的方法构建突变体,测定野生型及突变株的生长曲线、趋化性、胞外多糖的分泌、生物膜的形成及细胞絮凝等表型。【结果】三种菌株的生长速率基本无差,与野生型菌株相比突变株鞭毛结构丧失,趋化能力、分泌的胞外多糖和生物膜形成能力均下降,但相同时间内细胞絮凝程度比野生型明显。【结论】实验表明,鞭毛基因fliN、fliM对茎瘤固氮根瘤菌ORS571鞭毛的形成、趋化运动、胞外多糖的分泌、生物膜的形成及细胞絮凝能力等均有调控作用。     

Genome Analysis inNeurospora crassa;Cloning of Four Lociarginine-1(arg-1),methionine-6(met-6),unknown-7(un-7), andribosome production-1(rip-1) and Associated Chromosome Walking

We have cloned fourNeurospora crassagenes by complementation analysis. Cloned genes include thearginine-1(arg-1),methionine-6(met-6),unknown-7(un-7), andribosome production-1(rip-1) loci. Chromosome walks were initiated in ordered cosmid libraries from the cloned loci. A total of about 700 kb of theNeurosporagenome is covered in these walks.     

Oenothera mitochondrial orf454, a gene involved in cytochrome c biogenesis corresponds to orf169 and orf322 of Marchantia

We have characterized a mitochondrial gene in Oenothera, designated orf454, capable of encoding a component of the cytochrome c biogenesis system. This open reading frame is interrupted by an intron of 941 nucleotides showing high similarity to a group II intron residing in the rpl2 gene. RNA editing, which is observed at 18 cytidine positions within the orf454 reading frame, improves the similarity to protein-coding sequences in bacteria and higher plants and removes the last 16 amino acids. orf454 also shows high sequence similarity to two overlapping reading frames (orf169 and orf322) of Marchantia mitochondria. These ORFs belong to an operon-like cluster of genes in the liverwort that is not conserved in Oenothera mitochondria. However, in bacteria these reading frames are organized like the Marchantia gene cluster. It has been shown by genetical analysis in Rhodobacter capsulatus that these genes are essential for cytochrome c biogenesis. Genes of bacterial operons — ccl1 in Rhodobacter and yejR and nrfE in Escherichia coli — show high sequence similarity to the mitochondrial reading frames orf577 and orf454 of Oenothera. orf454, which we describe here, is homologous to the C-terminal region of these bacterial genes, while the previously described orf577 is homologous to the N-terminal region.     

甘菊ClHSP70与ClHSP90基因的克隆及表达分析

该研究以甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)为实验材料,通过RT-PCR方法从甘菊转录组数据中分离出热激蛋白合成相关基因,命名为ClHSP70和ClHSP90。序列分析表明,ClHSP70基因ORF全长为2 559bp,编码852个氨基酸,蛋白功能区预测表明含有典型的HSP70蛋白NBD和SBD保守结构域;ClHSP90基因ORF全长为2 094bp,编码697个氨基酸,含有HATPase结构域和HSP90保守结构域。生物信息学分析表明,甘菊ClHSP70与大豆(Glycine max)和烟草(Nicotiana tomentosiformis)HSP70蛋白有较高的一致性,ClHSP90基因编码的氨基酸序列与紫茎泽兰(Ageratina adenophora)HSP90高度相似;实时荧光定量表达分析表明,在42℃处理不同时间,甘菊叶片中ClHSP70和ClHSP90基因表达均在0.5h时显著增加,1h达到最大值,2h后缓慢下降;不同组织表达分析表明,甘菊在42℃处理1h后,ClHSP70在成熟叶中的表达量显著高于嫩叶和根等其他组织;ClHSP90在成熟茎中的表达量最高。研究说明,ClHSP70和ClHSP90基因具有热激蛋白特征,参与了甘菊热胁迫应答过程,该研究结果为以后深入研究其基因功能奠定了基础。     

TFS1: A suppressor of cdc25 mutations in Saccharomyces cerevisiae

Summary The TFS1 gene of Saccharomyces cerevisiae is a dosage-dependent suppressor of cdc25 mutations. Overexpression of TFS1 does not alleviate defects of temperature-sensitive adenylyl cyclase (cdc35) or ras2 disruption mutations. The ability of TFS1 to suppress cdc25 is allele specific: the temperature-sensitive cdc25-1 mutation is suppressed efficiently but the cdc25-5 mutation and two disruption mutations are only partially suppressed. TFS1 maps to a previously undefined locus on chromosome XII between RDN1 and CDC42. The DNA sequence of TFS1 contains a single long open reading frame encoding a 219 amino acid polypeptide that is similar in sequence to two mammalian brain proteins. Insertion and deletion mutations in TFS1 are haploviable, indicating that TFS1 is not essential for growth.     

An extragenic suppressor ofprp24-1 defines genetic interaction betweenPRP24 andPRP21 gene products ofSaccharomyces cerevisiae

The temperature-sensitiveprp24-1 mutation defines a gene product required for the first step in pre-mRNA splicing. PRP24 is probably a component of the U6 snRNP particle. We have applied genetic reversion analysis to identify proteins that interact with PRP24. Spontaneous revertants of the temperaturesensitive (ts)prp24-1 phenotype were analyzed for those that are due to extragenic suppression. We then extended our analysis to screen for suppressors that confer a distinct conditional phenotype. We have identified a temperature-sensitive extragenic suppressor, which was shown by genetic complementation analysis to be allelic toprp21-1. This suppressor,prp21-2, accumulates pre-mRNA at the non-permissive temperature, a phenotype similar to that ofprp21-1. prp21-2 completely suppresses the splicing defect and restores in vivo levels of the U6 snRNA in theprp24-1 strain. Genetic analysis of the suppressor showed thatprp21-2 is not a bypass suppressor ofprp24-1. The suppression ofprp24-1 byprp21-2 is gene specific and also allele specific with respect to both the loci. Genetic interactions with other components of the pre-spliceosome have also been studied. Our results indicate an interaction between PRP21, a component of the U2 snRNP, and PRP24, a component of the U6 snRNP. These results substantiate other data showing U2–U6 snRNA interactions.     

中国黑粉菌属和利罗黑粉菌属

黑粉菌属是Roussel 1806年建立的,全世界记载有三百余种,主要寄生于禾本科,是经济作物及牧草的重要致病菌·长期以来,对黑粉菌的邢子使用过各种名称,如厚垣孢子,冬孢子及黑粉孢子等.本文采用黑粉孢子以区别锈菌的冬孢子. 芳’(1979)在《中国真菌总汇》中列出黑粉菌属五十种及一个变型.作者经过显微结构和超显微结构的研究,承认其中二十九种为正确名称,八种及一变型为异名,顶黑粉菌(Ustilago acrearus Berk.)由于错拼而被废弃.埃地黑粉菌(Ustilago emodensis Berk.)被转移至利罗粉菌属(Liroa).另有十一种黑粉菌因缺少标本留待今后订正.自1979年以后,杨信东(1983)增加黑粉菌属二种我国新纪录,K.范基和郭林(1986)描述一新种,四种新纪录.在本文中,作者描述一新种:鸢尾蒜黑粉(Ustilago ixiolirii Guo L) ,孢子堆生在蒴果内,不开裂,黑色,粉末状.黑粉孢子球形,近球形,稀椭圆形, 12.5-21×10-21μm,黑褐色,壁厚1-1.Sμm,纹饰脑状.是迄今生在石蒜科植物上唯一黑粉菌的种,其它几种黑粉菌均属条黑粉菌属.本文增加七种我国新纪录.共计四十九种,寄生于六科四十四属植物,主要是禾本科和蓼科.这仅是黑粉菌属研究的初步报告,在全国范围内大量采集黑粉菌标本后,作者相信会有更多新种和我国新纪录被发现.利罗黑粉菌属(Liroa)是从黑粉菌属(Ustaligo)分出的,此属为单种属.     

Novel alleles ofcdc13 andcdc2 isolated as suppressors of mitotic catastrophe inSchizosaccharomyces pombe

Cell cycle control in the fission yeastSchizosaccharomyces pombe involves interplay amongst a number of regulatory molecules, including thecdc2, cdc13, cdc25, weel, andmik1 gene products. Cdc2, Cdc13, and Cdc25 act as positive regulators of cell cycle progression at the G2/M boundary, while Wee1 and Mik1 play a negative regulatory role. Here, we have screened for suppressors of the lethal premature entry into mitosis, termed mitotic catastrophe, which results from simultaneous loss of function of both Wee1 and Mik1. Through such a screen, we hoped to identify additional components of the cell cycle regulatory network, and/or G2/M-specific substrates of Cdc2. Although we did not identify such molecules, we isolated a number of alleles of bothcdc2 andcdc13, including a novel wee allele ofcdc2, cdc2-5w. Here, we characterizecdc2-5w and two alleles ofcdc13, which have implications for the understanding of details of the interactions amongst Cdc2, Cdc13, and Wee1.     

赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析

为了解赤桉(Eucalyptus camaldulensis)肌动蛋白(Actin)在生长发育过程中的功能,根据赤桉幼苗转录组数据库中的肌动蛋白基因序列,从赤桉嫩叶中克隆了2条Actin基因片段,并利用RACE技术获得Actin基因的全长cDNA,分别命名为ECACT1和EC-ACT2基因。生物信息学分析表明,这两条基因的全长cDNA分别为1533 bp和1387 bp,均含有1个编码377个氨基酸的开放阅读框。经比对分析,赤桉Actin蛋白的氨基酸序列与其他植物Actin蛋白的具有较高的相似性,并且具有Actin蛋白特有的保守序列和相关特征。因此推测这两条基因对桉树的生长发育具有一定的调控作用。     

Characterization of CaGSP1, the Candida albicans RAN/GSP1 homologue

Gsp1p is a small nuclear-located GTP binding protein from the yeast Saccharomyces cerevisiae. It is highly conserved among eucaryotic cells and is involved in numerous cellular processes, including nucleocytoplasmic trafficking of macromolecules. To learn more about the GSP1 structure/function, we have characterized its Candida albicans homologue. CaGsp1p is 214 amino acids long and displays 91% identity to the ScGsp1p. There is functional complementation in S. cerevisiae, and its mRNA is constitutively expressed in the diploid C. albicans grown under various physiological conditions. Disruption of both alleles was not possible, suggesting that it could be an essential gene, but heterozygous mutants exhibited genomic instability.