中华大蟾蜍γ-肌动蛋白基因Bbgγ-Actin的克隆与生物信息学分析

旨在获得中华大蟾蜍肌动蛋白序列全长。以中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)耳后腺为材料,提取总RNA,通过转录组高通量测序快速得到中华大蟾蜍肌动蛋白基因(Bbg Actin)cDNA全长2 055 bp,通过RT-PCR技术对其ORF序列进行验证,并对Bbg Actin基因进行分析。序列分析表明,Bbg Actin基因开放阅读框长1 131 bp,编码376个氨基酸。通过BLAST P程序分析,所得序列与Gen Bank数据库中肌动蛋白基因序列相似度均在89%以上,氨基酸序列的相似性达90%以上。系统进化分析表明,Bbg Actin与γ-Actin聚为一类,所得中华大蟾蜍肌动蛋白属于γ-Actin。首次获得了中华大蟾蜍γ-Actin cDNA全长序列。     

白桦肌动蛋白(Actin)基因全长cDNA克隆与序列分析

以白桦(Betula platyphylla Suk.)次生木质部为材料,用改良CTAB方法提取总RNA。根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物后进行RT-PCR,并采用RACE技术扩增出Actin基因全长序列。该基因cDNA全长1 785 bp,序列分析表明,该基因编码区1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区157 bp,3′非编码区495 bp。所得序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上。此基因已在GenBank注册（EU588981）。根据高等植物肌动蛋白相似性构建了进化树,表明白桦肌动蛋白与蓖麻肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。     

建兰Actin基因cDNA全长的克隆及其表达分析

根据单子叶植物的肌动蛋白基因(Actin)的保守区序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术从建兰(Cymbidium ensifolium)中分离出Actin基因cDNA全长.序列分析结果表明,建兰Actin基因长度为1 434 bp,编码区长度为1 134 bp,编码377个氨基酸,将其命名为CeActin,GenBank登录号为JN613147.CeActin推导的氨基酸序列与其他植物的同源性都较高,具有高度的保守性.采用半定量RT-PCR技术分析CeActin在建兰各组织及花不同发育时期的表达情况,结果表明,表达量没有明显差异,表明CeActin基因可作为内参基因.     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析北大核心CSCD

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。     

绵刺肌动蛋白基因的分离及特性分析

本研究采用兼并PCR(polymerase chain reaction)和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术分离了绵刺(Potaninia mongolica Maxim.)肌动蛋白基因(Actin,Pm Actin)c DNA序列,该序列包含有1 134 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码377个氨基酸,预测蛋白分子量为41.8 k D,理论等电点为5.48;基因组DNA序列长度为1 134 bp,无内含子。该序列与其他植物Actin的一致性较高,核苷酸均高于88%,氨基酸则均高于96%。系统进化分析显示:Pm Actin与同属蔷薇科的草莓、碧桃,扁桃和蔷薇及葡萄科的葡萄Actin蛋白聚为一个亚类,与草莓Actin蛋白亲缘关系最为接近。RT-PCR分析显示,该基因在根、茎、叶中的表达量无明显变化,该结果验证了Pm Actin基因可作为分子内标的可靠性,为深入开展该植物的分子生物学研究提供理论依据。     

千里光肌动蛋白基因（Actin）的生物信息学及功能分析

肌动蛋白（Actin）是广泛存在于高等植物中的组成型表达蛋白质,与细胞分裂、细胞运动、细胞信号转导等功能密切相关。为明确肌动蛋白性质与功能的关系,本研究从千里光全长cDNA文库中分离得到Actin基因。序列分析结果表明：该基因长度为1 481 bp,编码360个氨基酸残基的多肽,与甘草Actin基因编码的氨基酸序列（GenBank登录号：ABW71681.1）的同源性最高,达96%;预测蛋白质的分子量为40.02 kDa,理论等电点为5.85;结构分析发现,螺旋结构和无规则卷曲构成Actin二级结构的主要组分;三级结构预测发现,Actin具有4个结构域;蛋白系统发生树发现,与甘草和鹰嘴豆的亲缘关系较近。本研究认为,高等植物Actin可能参与基因的转录调控,其氨基酸突变位点未对功能结构域产生影响。     

球根白丝膜菌γ-actin基因的克隆及表达分析

根据真菌肌动蛋白(actin)基因保守区序列设计引物,用简并PCR法和RACE技术分离得到球根白丝膜菌(Leucocortinarius bulbiger)γ-肌动蛋白基因(Lb-act)的全长cDNA序列。该序列全长为1 357 bp,包含一个1 137 bp的开放阅读框(ORF),编码378个氨基酸,5'端非翻译区(5'UTR)92 bp,3'UTR长度128 bp。Port Param软件在线分析结果表明,该cDNA所编码的蛋白质理论等电点为5.12,相对分子质量为95.022 kD,具有真菌γ-actin基因3个保守特征序列。Blast同源性检索结果表明,Lb-act氨基酸序列与担子菌肌动蛋白序列有较高的相似性,其与双色蜡蘑的肌动蛋白氨基酸序列的亲缘关系最近。Lb-act基因在不同碳源及磷水平培养条件下表达量基本一致,验证了该基因作为分子内标的可靠性。     

虾夷扇贝β-actin基因的克隆和序列分析

为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5′端测序,比对,筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。肌动蛋白基因cDNA全长1536bp(不包括polyA),5′端非编码区84bp,3′端非翻译区321bp,阅读框1131bp,编码377个氨基酸。在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。系统发育分析显示该肌动蛋白属于β类型。本研究得到的虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其它功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。     

马铃薯StPSKRs基因的克隆及其亚细胞定位分析

该研究采用同源克隆与PCR扩增方法,从马铃薯品种‘Desiree’中克隆植物磺肽素受体基因StPSKR1和StPSKR2的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析及亚细胞定位分析,为深入研究StPSKR1和StPSKR2基因在马铃薯生长发育和生物胁迫中的作用提供理论依据。结果发现:(1)通过同源克隆与PCR扩增获得StPSKR1和StPSKR2的全长cDNA片段,并将其克隆到pGWB5-GFP载体;测序结果显示这2个基因编码的蛋白质与数据库给定的蛋白质序列保持一致,表明成功克隆到StPSKR1和StPSKR2基因。(2)StPSKR1位于马铃薯1号染色体上,cDNA全长3 042 bp,编码1 013个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为112.16 kD,理论等电点6.27;StPSKR2位于7号染色体,cDNA全长3 135 bp,编码1 044个氨基酸,相对分子量为114.99 kD,理论等电点6.19。(3)生物信息学分析显示,StPSKR1和StPSKR2都属于跨膜蛋白。(4)亚细胞定位结果显示,StPSKR1和StPSKR2均定位于细胞膜上。     

鹅掌楸LcUGE基因的克隆和组织表达分析

为了解鹅掌楸(Liriodendron chinense)的UGE基因功能,采用RACE和EPIC-PCR技术克隆到2个UGE基因,命名为LcUGE1和LcUGE2。结果表明,LcUGE1基因的c DNA全长为1 531 bp,包含1 050 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸, gDNA长度为11 920 bp;LcUGE2基因的c DNA长度为1 378 bp,包含1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,g DNA长度为6544 bp。LcUGE1和LcUGE2基因均含有9个外显子和8个内含子,且外显子长度和内含子剪切位点序列几乎一致,但内含子片段长度存在显著差异。编码的LcUGE1和LcUGE2蛋白高度保守,保守性达到82%。LcUGE1基因在雄蕊中表达量最高,而LcUGE2基因则在花萼中表达量最高。这表明LcUGEs基因可能参与鹅掌楸的生殖发育过程。     

马尾松PmPGK1和PmGPIC基因的克隆和表达分析

为了解马尾松（Pinus massoniana）磷酸甘油酸激酶1（PGK1）与胞质溶胶葡萄糖磷酸异构酶（GPIC）的功能，采用RACE技术克隆了PmPGK1和PmGPIC基因，并进行了生物信息学分析与亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR技术分析PmPGK1和PmGPIC的表达特性。结果表明，PmPGK1和PmGPIC全长为2 106和1 848 bp，分别编码507和566个氨基酸。PmPGK1和PmGPIC分别定位于叶绿体和胞质溶胶。PmPGK1表达量为新叶 > 老叶 > 新茎 > 根 > 花；而PmGPIC为老叶 > 花 > 新叶 > 新茎 > 根。低温胁迫24 h，PmPGK1和PmGPIC的表达量均随时间延长先降低后升高，且PmGPIC的表达量在处理2 h后即降至较低水平；高浓度CO₂胁迫24 h，PmPGK1的表达量随时间延长呈降低-升高-再降低的变化趋势，PmGPIC的表达下调但变化较不显著。因此，推测PmPGK1主要参与卡尔文循环及叶绿体/质体糖酵解，PmGPIC主要参与细胞质基质糖酵解；PmPGK1、PmGPIC活性在低温胁迫下均受抑制；PmPGK1活性在CO₂胁迫下受到显著抑制，而PmGPIC活性的影响不大。     

巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析

为了解蔗糖合成酶在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)生长和发育过程中的功能,利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆了蔗糖合成酶基因,并对基因的表达特征进行了分析。结果表明,从巴西橡胶树中克隆了两个蔗糖合成酶基因(HbSS1和HbSS2),HbSS1全长2864 bp,编码806个氨基酸;HbSS2全长2815 bp,编码811个氨基酸。两个基因编码的蛋白具有典型的植物蔗糖合成酶结构特征,包含1个磷酸化位点和两个保守的功能域。半定量RT-PCR分析表明,HbSS1和HbSS2在各组织器官中均有表达,其中HbSS1在叶中的表达量最高,HbSS2在树皮中的表达量最高,这说明HbSS1和HbSS2可能参与了各组织的生长和代谢过程,且功能有所分化。     

罗汉果色氨酸转氨酶基因SgTAR2的克隆及表达分析

色氨酸转氨酶基因家族,是直接参与植物生长素生物合成途径的关键酶基因。该研究在罗汉果转录组测序的基础上,结合RACE技术克隆罗汉果色氨酸转氨酶基因SgTAR2的全长cDNA序列和DNA序列;并对其进行生物信息学分析和时空表达分析。结果表明:克隆所得SgTAR2的cDNA全长序列2078bp,最长ORF为1332bp,编码443个氨基酸,Gen Bank登录号为KU949381,其编码蛋白具有2个蒜氨酸酶保守结构域和多个5'-PLP结合位点,推测其可能参与催化色氨酸转氨基作用、化学防御作用、生长素生物合成等生物学过程;SgTAR2基因DNA长为4103bp,含有4个内含子和5个外显子,其内含子具有多个高水平转录调控因子和多个与激素、环境等胁迫响应相关的作用元件,暗示SgTAR2基因内含子协同调控罗汉果生长素合成、抗胁迫反应、形态发育等生物学过程。实时荧光定量结果显示,SgTAR2基因在罗汉果各组织器官均有表达,在雌蕊和15d幼果期表达量较高,暗示该基因参与罗汉果果实早期发育。该研究结果表明SgTAR2参与了生长素介导的罗汉果不同生长发育过程,特别对幼果及花的起始发育和器官形态建成等具有重要意义。     

巴西橡胶树HbWRKY1基因的克隆及转化烟草的初步研究

利用RACE结合RT-PCR技术,从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)总RNA中扩增得到长度为1234 bp的WRKY基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对,该序列推导的氨基酸序列与蓖麻、白杨的WRKY同源性分别为79%和73%,表明分离的cDNA序列为橡胶树WRKY基因,命名为HbWRKY1。通过构建pCAMBIA1304-HbWRKY1植物表达载体,经农杆菌GV3101介导,将HbWRKY1基因导入烟草(Nicotiana tabacum)中,对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR鉴定。结果表明,HbWRKY1基因已整合到65株转基因植株中。干旱胁迫试验表明,HbWRKY1的过量表达可以明显提高转基因烟草对干旱胁迫的耐受能力。这说明WRKY基因与橡胶树抗旱能力之间存在一定的关系。     

沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

植物自交不亲和性是植物生殖过程中普遍存在的一种现象,是植物特异性识别并拒绝自身花粉或亲缘关系很相近的花粉的一种遗传机制。无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,IPPase)在植物生长发育方面起重要作用。该研究根据沙田柚花柱消减文库中EST序列(无机焦磷酸酶基因内部片段),设计了2对特异引物5'-GSP1,5'-n GSP1,3'-GSP2 and 3'-n GSP2,通过SMART-RACE PCR技术从所构建的沙田柚花柱抑制性消减文库中克隆了沙田柚无机焦磷酸酶基因的c DNA全长序列,利用Blastn、DNAman和Expasy软件对所克隆的基因进行同源性分析,以及基因编码的氨基酸的分子量、等电点、疏水性等理化性质分析。结果表明:IPPase基因c DNA全长为1 136 bp(Gen Bank登录号为KF990474),开放阅读框(ORF)全长为654 bp,共编码217个氨基酸,包括170 bp 5'UTR和312 bp的3'UTR;编码的蛋白质的分子量为24.4 k Da,等电点为5.96;蛋白结构域分析显示沙田柚IPPase与焦磷酸酶具有相同的保守结构域;对沙田柚IPPase蛋白质序列进行疏水性分析,结果表明沙田柚IPPase基因编码的肽链中疏水性最大值约为3.21,最小值约为-2.98,属于亲水性蛋白,无跨膜区域;Blastn搜索的结果显示,沙田柚IPPase基因序列与多种植物的IPP基因高度同源;序列分析表明,沙田柚IPPase基因核苷酸的同源性与毛果杨(Populus trichocarpa)和橡胶树(Hevea brasiliensis)IPPase基因均为87%;氨基酸序列与克莱门柚(Citrus clementina)无机焦磷酸酶完全一致。该研究结果可为深入研究无机焦磷酸酶在沙田柚自交不亲和中的作用机理提供基础。     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

毛尖紫萼藓抗旱相关基因Gp-LEA的克隆与表达分析

以毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得的一段与LEA基因同源性较高的EST序列为基础,采用RACE技术分离该基因cDNA全长序列,命名为Gp-LEA。Gp-LEA基因的cDNA全长814bp,开放阅读框456bp,编码含151个氨基酸蛋白质。生物信息学分析结果显示,Gp-LEA蛋白为稳定蛋白,分子质量为16.612kD,理论等电点（pI）为5.06,含有LEA₂功能结构域,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。系统发生分析表明,Gp-LEA基因编码蛋白与花旗松LEA蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,Gp-LEA基因在复水和快速干旱模式下均能表达。推测Gp-LEA基因在毛尖紫萼藓的复水和干旱过程中起着重要作用。     

茶树CsCBF1基因克隆和转录活性分析

采用RACE技术克隆了一个受冷诱导的茶树CBF基因全长cDNA,命名为CsCBF1(GenBank登录号为EU563238)。CsCBF1cDNA全长序列为1 211bp,开放阅读框编码259个氨基酸。氨基酸序列分析表明,CsCBF1具有CBF家族典型的保守结构域,与其他植物的CBF具有较高的相似性;与拟南芥、辣椒和橡胶树编码的CBF相似性分别为56%、63%和56%。亚细胞定位结果表明,CsCBF1位于细胞核内。分别将10个CsCBF1缺失突变体与GAL4DNA结合域融合的结果显示,CsCBF1的羧基末端酸性结构域(第137位氨基酸至259位氨基酸)在酵母中具有转录激活活性。实时定量RT-PCR分析表明,CsCBF1基因受低温的快速诱导表达。