绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因在大肠杆菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因亚克隆到表达载体pET-22b（＋）,构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21（DE3）。利用金属亲和层析对重组EGⅢ进行纯化,纯化后酶比活力达到6u／mg蛋白,最适反应温度为60℃,最适pH为4．0。同时对EGⅢ催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGⅢ的2．8倍和3．45倍。突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5．4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化。两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65℃和4．4。     

枯草芽孢杆菌β-糖苷酶的克隆表达、体外定向进化及结构模拟

摘要:【目的】从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出bglC基因并在大肠杆菌中表达,分析表达产物的酶学性质并进行结构模拟,为进一步研究其生理功能及结构解析奠定基础。【方法】将bglC基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,通过定向进化获取水解效率提高的突变株,经Ni-NTA镍离子层析柱纯化后,测定野生枯草芽孢杆菌β-糖苷酶与突变酶的性质。利用CD光谱,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及三维结构建模,分析野生酶与突变酶的高级结构。【结果】野生酶的比活力为9.7 U/mg,最适催化温度为60℃,最适pH值是7.0。经过突变和筛选,我们得到一个突变体BS-GLY_M1(A242T/T385A/S425L),其比活力达到17.1 U/mg,最适温度为55 ℃,最适pH值是7.0,在55 ℃下的半衰期为3.5 h,比野生酶增加2 h。突变酶对4-硝基苯基-β-半乳糖苷、乳糖和熊果苷的催化效率(Km/Kcat)有所提高。酶在天然条件下以二聚体、四聚体状态存在,推测它以二聚体为基本功能单位。结构模拟结果表明突变后酶的三维结构有轻微地变化,这可能是酶热稳定性和催化效率提高的原因。【结论】枯草芽孢杆菌β-糖苷酶可以在大肠杆菌中高效表达并可以通过定向进化提高其水解效率。     

鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造

【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH 6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50 °C,在此温度下保温1 h酶活无显著变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体R169H的构建及酶学性质表征

【目的】提高北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)中天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)活力。【方法】利用定点突变技术对AK基因进行突变,并将突变体转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中异源表达。重组菌经超声破碎后、利用镍柱对AK进行纯化,并经SDS-PAGE和Western blot验证。通过检测酶活力比较突变体和野生型动力学变化并研究突变体和野生型的部分酶学性质。【结果】成功构建突变体R169H。经验证知,AK分子量为48kDa。突变体R169H的Vmax为226.3 U/mg·s-1,较野生型提高2.3倍。最适反应温度为26℃,与野生型经验值相同;最适反应pH为9.0,较野生型经验值8.0有所提高;在最适温度和pH值下的半衰期为5.5 h,比野生型的4h稳定性要好;代谢产物赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸在低浓度时对AK均具有激活作用。【结论】突变体中R169与E92间氢键消失,能够影响亚基间聚合度,降低酶对底物的亲和力,减弱代谢产物对AK的反馈抑制作用,从而使R169H中AK的Vmax提高2.3倍。     

植酸酶phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyA^m重组于大肠杆菌表达载体pET-30b（＋）,以重组表达载体pET30b-FphyA^e为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyA^m（在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-FphyA^m载体上13氨基酸残基）。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA^e在GS115酵母中表达。纯化的突变酶pp-NP^e与野生型酶PP-NP^m-8相比：PP-NPA^e的最适反应温度上升了3气,75℃处理10min,热稳定性提高21％,比活力略有提高。最适反应pH为5．6,有效pH范围pH4,6到pH6．6。比未突变酶扩大了0.4单位。     

K178M、S170F、G180V突变对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

利用生物信息学分析黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-2,选择α-螺旋178位点、170位点和180位点氨基酸进行定点突变(K178M,S170F,G180V)获得突变木聚糖酶基因xyn MFV,构建重组表达载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)诱导表达。酶学性质分析对比发现,突变酶最适温度(50℃)比原酶(40℃)提高了10℃;40℃条件下保温1 h突变酶Xyn MFV相对酶活力下降到热处理前的56.0%,原酶Xyn ZF-2下降到42.0%;45℃时突变酶Xyn MFV的半衰期t_(1/2)为21 min,与原酶Xyn ZF-2(t_(1/2)=7 min)相比较提高了14 min。结果表明,K178M、S170F、G180V突变木聚糖酶可以提高Xyn ZF-2最适温度和热稳定性。     

黄鳝碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液(pH8.6)抽提,正丁醇处理,30%-75%硫酸铵分级沉淀分离,DEAE-Sepharose离子交换柱层析,Sephacryl S-200凝胶过滤纯化,从黄鳝内脏组织中分离纯化出电泳纯的碱性磷酸酶。该酶提纯倍数为564倍,比活力达到3015U/mg。酶学性质和动力学性质研究表明,该酶催化磷酸苯二钠的水解反应,最适pH值为10.2,pH小于7和大于12均不稳定;最适温度为40℃,温度高于50℃不稳定;米氏常数Km值为1.17mmo1/L。金属离子对该酶的催化活力有不同的影响,K+对该酶活力无影响,Mg2+对该酶有激活作用,Zn2+对该酶有抑制作用。       

嗜酸古菌Cuniculiplasma divulgatum来源的GH1家族中温β-葡萄糖苷酶CdBglA的原核表达及酶学性质分析

葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究的热点。本文对尚未报道的来源于嗜酸古菌(Cuniculiplasmadivulgatum)GH1家族的葡萄糖苷酶进行了克隆表达和酶学性质测定,以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。从NCBI数据库中获取了C. divulgatum来源的GH1葡萄糖苷酶氨基酸序列,然后制备重组质粒pET-30a(+)-CdBglA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白,对纯化后的CdBglA进行酶学性质研究。结果发现,重组酶CdBglA的分子量为56.0 kDa,最适pH为5.5,最适温度为55℃。该酶具有良好的pH稳定性,在pH 5.5-11.0范围内处理1 h,仍维持92.33%以上的酶活力。以p NPG为底物时的酶促反应动力学参数Km、Vmax和Kcat/Km分别为0.81 mmol、291.99μmol/(mg·min)和387.50s-1mmol-1。其在终浓度5mmol/L重金属离子的影响下均能保持90.33%以上的酶活力;在15%的乙醇溶液中酶活力被提高了28.67%,在2...     

毛栓菌胞外漆酶的纯化及部分性质研究

毛栓菌胞外漆酶经盐析、透析、sephadexG75和G2 5四步纯化 ,粗酶液被纯化了 39 1倍 ,比活力 12 152 ,回收率 4 5 3%。漆酶最适pH值为 4 0 ,最适反应温度为 30℃。K Cu 2 、Zn2 离子可激活漆酶 ,而Ag 、Fe3 离子可抑制漆酶的活性。漆酶的Km值为 1 81× 10 3mol/L。     

解淀粉芽孢杆菌凝乳酶的克隆、重组表达及酶学性质

为了实现解淀粉芽孢杆菌来源凝乳酶的异源表达,并探究重组凝乳酶的酶学性质。以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,扩增得到凝乳酶编码基因proMCE,构建了重组菌株E.coliBL21(pET28a-proMCE),并成功表达了重组凝乳酶。通过Ni柱亲和层析法纯化具有活性的凝乳酶,分子量大小约为28.5kDa,纯化后比酶活达到1096.97SU/mg,纯化倍数达到4.56倍,回收率为66.51%。对该重组酶酶学性质进行了初步研究,重组凝乳酶分别在70℃、65℃表现最大凝乳酶活力与蛋白酶活力,60℃处理20min,凝乳酶活力与蛋白酶活力均被钝化80%,为热不定性酶。酶的最适反应pH为5.0。在pH5~7条件下处理后,凝乳酶活力相对稳定,能保留超过70%的活力。