沉默调控基因Sir2的结构与功能

首先在酵母 (Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉａｅ)中发现的Ｓｉｒ基因家族 (Ｓｉｒ1、Ｓｉｒ2、Ｓｉｒ3、Ｓｉｒ4)是调节染色质沉默的重要基因。在酵母的衰老过程中 ,染色质的沉默可能是衰老的机制之一 ,处于沉默状态的染色质中的许多基因无转录活性 ,可能由此影响酵母生长。Ｓｉｒ基因的突变能影响酵母的寿命[1] 。1 .Ｓｉｒ2基因酵母共有 1 7条染色体 ,Ｓｉｒ2位于第 4条染色体的左臂上 ,全长 464 9ｂｐ。编码一个 562个氨基酸的蛋白质 ,编码区的前端有一段前导序列 (ＳＬ)。其ｃＤＮＡ序列包括一个 1 689全碱基开放阅读框架 ,一…     

组蛋白去乙酰化酶SIR2与染色质沉默

DNA的大部分区域通过包装成特殊的染色质结构而失去活性称为染色质沉默。这些特殊的染色质结构在维持染色体结构稳定和基因调控中起重要作用。有实验表明,沉默染色质的组蛋白H3和H4的的氨基末端尾部相对于基因组的其他区域是低乙酰化的。组蛋白去乙酰化酶SIR2（silent information regulator2）是参与染色质沉默的一种重要的蛋白质。SIR2具有两种相关联的酶活性,组蛋白去乙酰化酶活性和NAD高能骨架的断裂活性,并在酶反应过程中产生一种新的产物氧代乙酰基ADP核糖基（O-acetyl-ADP-ribose）。SIR2的组蛋白去乙酰化酶活性为研究SIR2与沉默染色质的组蛋白低乙酰化状态的关系提供了直接证据。而SIR2的这两种酶活性的关系也表明,组蛋白去乙酰化酶活性不是SIR2惟一的功能。SIR2的NAD水解酶活性和O-acetyl-ADP-ribose的合成过程也可能是染色质沉默机制所必需的。 Abstract:Chromatin silencing is the inactivation of large domains of DNA by packaging them into a specialized inaccessible chromatin structure.This type of inactivation is involved in the regulation of gene expression and is also associated with the chromosome structures required for chromosome maintenance and inheritance.Silent information protein 2(SIR2) is one of the important proteins involved in chromatin silencing.It is clear that SIR2 has two coupled enzymatic activities,histone deacetylation and NAD breakdown activities,and produces a novel compound,O-acetyl-ADP-ribose in the enzymatic reactions.The histone deacetylation activity of SIR2 provides the direct link between SIR2 and the hypoacetylation of silent chromatin.Moreover,the relationship between the NAD cleavage and the deacetylase activity of SIR2 shows that the histone deacetylase activity is not its only crucial function.The breakdown of NAD C-N bond and the synthesis of O-acetyl-ADP-ribose may also be involved in chromatin silencing.     

染色质重塑和高等植物开花时间控制

染色质的结构和组成直接影响转录因子与基因启动子的结合,并最终导致基因的活化或沉默。多年来在酵母和动物等领域的研究已经证实,起关键调节作用的转录因子表达模式的建立和维持需要染色质重塑。外界和细胞内部信号介导的染色质重塑调控基因的表达,并最终调控细胞的分化和生物个体的发育。近几年人们发现高等植物也存在与动物和酵母同源的参与染色质重塑的蛋白质因子。最近的研究结果表明,决定高等植物开花时间关键基因的表达调控就是通过外界信号影响其染色质结构实现的。     

抗人Elp3 的N末端抗体制备及在染色质免疫沉淀中的应用

人 Elp3（human elongator protein 3, hElp3）具有组蛋白乙酰转移酶活性,是与延伸中的 RNA 聚合酶Ⅱ结合的 elongator 复合物的催化亚基,可参与组蛋白的乙酰化修饰与基因的转录延伸. Elp3 及其复合物功能异常与人类多种疾病相关. 为运用染色质免疫沉淀等手段深入研究 Elp3 功能,PCR 法克隆 pYES2-hElp3 质粒中编码 hElp3的N端亲水区段（1～69 氨基酸残基）,构建原核表达载体 pMXB10-hElp3-210,经 IPTG 诱导和几丁质柱纯化后,免疫兔制备多克隆抗体. ELISA 检测显示,该抗体有较高的效价(不低于1∶2　500).免疫印迹实验结果表明,该抗体可与纯化的及 HeLa 细胞中的 hElp3 蛋白特异性结合.运用该抗体对转入 elp3Δ菌株的人 Elp3 的染色质免疫沉淀实验结果表明,人 Elp3 可参与酵母 SSA3 基因的转录调控,这可能是人Elp3 能够部分补偿酵母 SSA3 基因延迟表达缺陷的原因.     

Sirtuin:依赖NAD+的去乙酰化酶

组蛋白的乙酰化一去乙酰化修饰在基因表达调控中起重要作用。参与去乙酰化的酶除了经典的Ⅰ类和Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC),还有比较特殊的Ⅲ类HDAC——Sirnlin,其活性依赖于NAD^ 。酵母的Sirtuin——Sir2在交配型基因沉默、端粒区基因沉默、rDNA沉默中起重要作用．还可能参与长寿与衰老的调节。在人类,Sirtuin的底物是组蛋白、各种转录因子如p53、FOXO、NF—KB、乙酰化酶如D300和其他的各种功能蛋白质。根据底物特点推测,人类Sirtuin蛋白的生理功能可能一方面是参与调节细胞在应激条件下的存活与死亡的平衡,另一方面是参与代谢的调节。     

沉默交配型信息调节因子2同源蛋白Sirt1

沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,Sirt1)是哺乳动物中与酵母沉默信息调节蛋白2(silencing information regulator 2,Sir2)高度同源的蛋白质,它是一种依赖NAD+的III类组蛋白去乙酰化酶(HDAC III),在细胞分化、衰老、凋亡、DNA损伤修复、能量及内分泌代谢调节中起重要作用,同时在基因沉默、表观遗传学修饰、转录调控及信号转导调节中发挥重要的生物学功能。本文对其近年的研究进展做一概述。     

芽殖酵母和裂殖酵母中异染色质形成机制

芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)是用来研究异染色质形成、细胞周期、DNA复制等重要细胞功能的理想单细胞真核生物.本文主要介绍这2种酵母中异染色质形成的机制.异染色质是一种抑制基因转录和DNA重组的特殊染色质结构.尽管在芽殖酵母和裂殖酵母中异染色质形成都需要组蛋白修饰,但异染色质建立的机制不同.在芽殖酵母中参与异染色质形成的主要蛋白是Sir1-4蛋白（其中Sir2为组蛋白H3去乙酰化酶）,而组蛋白H3赖氨酸9甲基化酶Clr4和异染色质蛋白Swi6在裂殖酵母异染色质形成中起关键的作用.在这两个酵母中,参与异染色质形成的组蛋白修饰蛋白由DNA结合蛋白招募到异染色质.此外,裂殖酵母也利用RNA干扰系统招募组蛋白修饰蛋白.     

多效生长因子通过JNK信号通路负调控Schlafen2基因表达

实验室前期研究发现,多效生长因子（pleiotrophin,PTN）基因稳定沉默的小鼠胚胎成纤维细胞中Schlafen2 (Slfn2)基因高表达.为了探讨Ptn沉默诱导Slfn2基因表达可能涉及的信号通路,应用Western印迹检测外源性PTN因子（终浓度50 ng/μl）对Ptn沉默细胞JNK磷酸化水平的影响;应用Northern 印迹分别检测JNK和p38通路特异性抑制剂对Ptn沉默细胞Slfn2基因转录水平的影响.结果发现,Ptn沉默细胞内JNK磷酸化水平高于对照细胞,外源性PTN处理后沉默细胞内JNK磷酸化水平下调;阻断JNK通路呈时间依赖性抑制Ptn沉默细胞中Slfn2基因转录,阻断p38通路对Ptn沉默细胞中Slfn2转录水平没有明显影响结果提示,Ptn可能通过抑制其下游JNK/MAPK通路来负调控Slfn2的表达.     

戊型肝炎病毒开放读框2的克隆及表达载体的构建

戊型肝炎病毒（HEV）为单股正链RNA病毒,整个基因组有3个开放性阅读框架（ORF）,ORF2（全长约1.98kb）是主要结构基因编码区。将经过PCR获得的ORF2基因插入非分泌型酵母穿梭质粒pPIC3,构成受醇氧化酶（AOX2）的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,重组质粒经酶切线性化后转化酵母细胞GS115,经过鉴定可挑取与酵母染色体发生交换的重组体,用于进一步的真核表达。     

核基质结合区与转基因沉默

核基质结合区(matrix attachment region,MAR)又叫支架附着区(scaffold attachment region,SAIL)是染色质被限制酶消化后仍与核基质或核骨架结合的DNA序列。转基因沉默主要发生在两个水平上,一是转录水平,二是在转录后水平。位置效应是引起转录水平基因沉默的重要因素。研究发现,用MAR构建的载体能够提高转基因的表达水平,能在一定程度上克服基因沉默．降低转基因在不同转基因系间的表达差异,增强外源基因表达的稳定性。