中国汉族apoB基因EcoRI、XbaI、MspI、Ins/Del及3＇端VNTR位点的多态性研究

目的：apo B基因多态性对群体遗传学、心血管疾病等研究领域有着重要的价值,本文分析了中国汉族人群中apoB基因EcoRI、XbaI、MspI、Ins/Del及3＇端VNTR等5个多态性位点的等位基因频率分布,为相关研究提供基础资料。方法：应用PCR-RFLP技术分析EcoRI、XbaI、MspI等3个位点的多态性分布,应用常规PCR方法分析Ins/Del及3＇端VNTR等2个位点的多态性分布。结果：1人群中EcoRI位点有E＋及E-两种等位基因,基因频率分别为87.1%和12.9%;XbaI位点有X＋及X-两种等位基因,基因频率分别为6.1%和93.9%;MspI位点有M＋及M-两种等位基因,基因频率分别为97.1%和2.3%;Ins/Del位点有Ins及Del两种等位基因,基因频率分别为70.7%和29.3%;3＇端VNTR位点有16种等位基因,其中以HVE34与HVE36最为常见,频率分别为33.4%与21%。2连锁不平衡分析表明,5个位点间除XbaI与Ins/Del间存在较弱的连锁不平衡（D＇=0.911,r2=0.175）,其余点位间无显著连锁不平衡。结论：数据比对表明,5个多态性位点的基因型和等位基因频率存在民族、种族差异,因此在apo B基因相关研究中应充分考虑遗传背景造成的影响。     

中国汉族apoB 基因EcoRI、XbaI、MspI、Ins/Del 及3''端VNTR 位点的多态性研究

目的:apo B基因多态性对群体遗传学、心血管疾病等研究领域有着重要的价值,本文分析了中国汉族人群中apoB基因EcoRI、XbaI、MspI、Ins/Del及3’端VNTR等5个多态性位点的等位基因频率分布,为相关研究提供基础资料。方法:应用PCR-RFLP技术分析EcoRI、XbaI、MspI等3个位点的多态性分布,应用常规PCR方法分析Ins/Del及3’端VNTR等2个位点的多态性分布。结果:1人群中EcoRI位点有E+及E-两种等位基因,基因频率分别为87.1%和12.9%;XbaI位点有X+及X-两种等位基因,基因频率分别为6.1%和93.9%;MspI位点有M+及M-两种等位基因,基因频率分别为97.1%和2.3%;Ins/Del位点有Ins及Del两种等位基因,基因频率分别为70.7%和29.3%;3’端VNTR位点有16种等位基因,其中以HVE34与HVE36最为常见,频率分别为33.4%与21%。2连锁不平衡分析表明,5个位点间除XbaI与Ins/Del间存在较弱的连锁不平衡(D’=0.911,r2=0.175),其余点位间无显著连锁不平衡。结论:数据比对表明,5个多态性位点的基因型和等位基因频率存在民族、种族差异,因此在apo B基因相关研究中应充分考虑遗传背景造成的影响。     

中国延边朝鲜族和延边汉族apoB,D17S30 VNTR多态性研究

应用聚合酶链反应(PCR) 法对中国延边朝鲜族和延边汉族apoB和D17S30 VNTR研究发现,中国延边朝鲜族和延边汉族等位基因频率总体分布具有显著性差异( P < 0105);apoB和D17S30 位点 VNTR 在中国延边朝鲜族和延边汉族中的观察杂合性、多态信息含量、个体鉴别力均大于017;中国延边朝鲜族和延边汉族中 D17S30 VNTR位点分别以 A3 和 A1 的频率为最高。结果表明,apoB和D17S30 VNTR 位点在中国延边朝鲜族和延边汉族中的等位基因频率分布具有很强的多态性,在研究中国延边朝鲜族起源、变迁以及与其他各民族间亲缘关系等方面具有广泛的应用价值,适用于中国延边朝鲜族和延边汉族的个体识别和亲子鉴定。     

载脂蛋白B基因单体型与中国维吾尔族自然长寿的关联研究

探讨载脂蛋白B(apolipoprotein B, apoB)基因单体型与维吾尔族自然长寿之间的关系. 选择新疆和田地区191名年龄90岁以上的健康维吾尔族个体为研究对象, 另选53名年龄65~70岁、民族、性别、地域相匹配的正常个体为对照. 采用PCR-SSP (sequence specific primer), PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)和PCR-直接测序(PCR-sequencing)等技术对apoB基因第1外显子5′端信号肽插入/缺失(insertion/deletion, I/D)、第26外显子XbaⅠ限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms, XbaⅠ-RFLP)和第29外显子3′端可变数目重复序列(variable number of tandemly repeat, VNTR)进行分型. 经Logistic 回归分析显示, 长寿组apoB基因X⁺X⁺基因型频率显著高于对照组; M, L的等位基因频率和其组成的基因型频率显著增高; 在单体型分析中, 长寿组中由X⁺和M等位基因组成的单体型频率显著增高, 而由X^-和S等位基因组成的单体型频率显著降低 (均P<0.05). 研究认为: 等位基因M, L, 基因型X⁺X⁺, MM, ML, LL和单体型I-X⁺-M, X⁺-M与自然长寿显著正相关, 可能为长寿的保护因素, 而等位基因S, 基因型SS和单体型X⁺-S, D-S和 D-X⁺-S则可能是影响长寿的不利因素.     

用长PCR方法检测含有较大缺失或插入的DNA大片段

选择位于19q13.3上的人类肌张力蛋白激酶基因(myotonin protein kina se gene,MT-PK)为靶基因(基因全长为14kb),以G+C含量较高且含有1kb缺失或插入,由基因第8内含子中的Alu±1kb的5'端至第15外显子3'非编码区中的CTG重复序列3'端,即两者间的距离为5.3kb的DNA片段为待扩增靶序列,通过优化DNA聚合酶的组合和反应缓冲体系,点考查了含有Alu-1k b和Alu+1kb缺失或插入的MT-PK等位基因片段共扩增的长PCR方法。本方法可有效地同步扩增6.5kb和5.5kb两个等位基因片段,对6.5kb和5.5kb纯合等 位片段则达到了更有效的扩增。     

高保真酶特异性检测大鼠SNP基因型新方法

目的应用高保真酶（Pfu）和3’末端修饰引物在单管双向等位基因特异性扩增（SB-ASA）中区分SNP基因型,建立高保真酶特异性检测SNP基因型的新方法。方法选取近交系大鼠SNP位点,以RS8149053为例,设计两个外部引物和两个等位基因特异性引物,四引物3’末端进行硫代磷酸化修饰,应用高保真聚合酶（Pfu）进行特异性扩增,扩增结果测序验证其可靠性。结果在RS8149053 SNP位点（C/T）上,等位基因型CC扩增出179 bp目的片段,基因型TT扩增出597 bp目的片段,基因型不同则扩增出分子量不同的片段,目的条带测序结果与Rat Genome Database数据库基因型结果一致,高保真酶扩增结果稳定且特异性强。结论高保真酶等位基因特异性扩增技术能有效降低假阳性率,是一种快速、特异的SNP基因分型新方法。     

鸡Myostatin基因单核苷酸多态性的群体遗传学分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR－SSCP和测序的方法发现了5个位于Myostatin基因5′－和3′－调控区的单核苷酸多态性位点,对北京油鸡、白耳鸡、石歧杂、矮小黄鸡、小型黄鸡、惠阳胡须鸡、隐性白羽鸡、海兰、AA鸡等不同鸡种的该单核苷酸多态性分析结果表明：Myostatin基因的5′调控区引物P60／P61扩增片段多态性是由3个核苷酸的改变而产生的[分别是G→A（304位）、A→G（322位）、G→（344位）],引物P93／P94扩增片段的多态性是由G→A（167位）突变造成的,引物P117。P118PC扩增片段多态性是由T→C（177位）造成的。3′调控我引物P80／P81扩增片段多态性是由第7263位A突变为T造成的,引物P76／P77扩增片段多态性是由A→G（6935位）造成的。不同鸡种群体遗传学分析表明,5′－调控区引物60／P61扩增片段多态性片段多态性是由A→G（6935位）造成的。不同鸡种群体遗传学分析表明,5′－调控区引物P60／P61扩增片段多态性位点在北京油鸡的基因型频率分布与其他的品种有很大的差异,其BB型频率为0．700,AA基因型频率仅为0．033,而其他鸡种中以A基因优势;对于引物P93／P94,品种间的基因型频率差异极显著（P＜0．01）,北京油鸡和AA鸡的EE型频率鸡种中以A基因占优势;对于引物P93／P94,品种间的基因型频率差异极显著（P＜0．01）,北京油鸡和AA鸡的EE型频率低于其他品种,白耳鸡和海兰蛋鸡以EE型为主,其频率高于其他品种;3′－调控区引物P80／P81多态怀位点在9个鸡种中都是等位基因C占优势。引物P76／P77,总体上MM型的频率较低,杂合子MN型的频率较高。     

牡丹CTR1基因家族基因片段及其cDNA 3′-末端的克隆与序列分析

以牡丹品种‘洛阳红’(Paeonia suffruticosa‘Luo Yang Hong’)花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的CTR1(Constitutive Triple Response 1)蛋白的保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到3条牡丹CTR1基因同源片段。利用其已知中间序列,通过3′快速扩增cDNA末端技术(3′RACE)及序列拼接,最终得到了这3个基因片段除5′末端外的全部cDNA序列,分别命名为PsCTR1、PsCTR2和PsCTR3。分析结果表明,由PsCTR1、PsCTR2和PsCTR3基因翻译的氨基酸片段与拟南芥和番茄的CTR1蛋白氨基酸序列的同源性均较高,分别为88%和85%;61%和61%以及70%和69%。     

猪H-FABP基因第三内含子的遗传变异

以马身猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪四个品种共190头猪为实验动物,成功扩增出猪H-FABP基因intron 3的全序列,全长1 350 bp,已向GenBank提交,检索号为DQ 002993。根据序列测定结果设计引物P2,扩增其中255bp的片段,应用PCR-SSCP分析发现P2-SSCP多态位点,该位点上具有两个等位基因A和B。在4个猪种中,AA基因型频率最高,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。序列测定的结果表明,P2-SSCP的变异是由碱基A→G的替换造成的。     

牛HTR1B基因的分子遗传特性研究

用PCR-SSCP技术研究了涉及肉牛和奶牛共计7品种HTR1B基因的编码区和3′侧翼区的多态性,以期为牛性情的标记辅助选择积累数据。扩增得到4个片段, 有3个片段存在(SSCP)多态性。对不同的SSCP带型对应片段进行测序, 共发现6个SNP多态位点(G205T、C507T、C546G、C744T、G816A和G942A)。各遗传群体内G205T、C744T、G816A和G942A 位点均处于Hardy-Weinberg平衡, 而C507T和C546G位点只有鲁西牛处于Hardy-Weinberg平衡。奶牛205T等位基因频率显著高于其他肉牛品种(χ2 = 6.87)。奶牛G205T位点多态信息含量为0.25, 其余各位点在不同群体内均小于0.10, 说明牛HTR1B基因较保守。     

多重等位基因特异性扩增—— 微流控芯片电泳法同时测定多个单核苷酸多态性位点

文章以微流控芯片电泳为检测平台, 建立了一种基于DNA适配器连接介导的多重等位基因特异性扩增同时测定多个单核苷酸多态性(SNP)位点的方法。以白细胞介素1β(IL1B)基因中的7个SNP位点(794C>T、1274C>T、2143T>C、2766T>del、3298G>A、5200G>A和5277C>T)为检测对象, 通过PCR预扩增得一段含该7个待测SNP位点的长片段; 用限制性内切酶MboⅠ将其消化成短片段, 再与DNA适配器(adapter)相连; 以连接产物为模板, 在两管中分别用7条等位基因特异性引物和一条公用引物进行7重等位基因特异性扩增; 最后用微流控芯片电泳法分离等位基因特异性扩增产物, 根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。采用本法成功测定了48名健康中国人的IL1B基因上的7个SNP位点, 与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)和测序法测定结果完全一致。本法结果准确, 可用于同时测定多个SNP位点; 以微流控芯片电泳作为检测平台, 分析速度快, 样品需要量少; 借助于自制筛分凝胶和重复使用芯片, 使得SNP分析成本大大降低。     

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因3′端cDNA的克隆及分析

实验利用3′-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3′末端cDNA的快速扩增并进行序列分析。将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3′sites Adaptor Primer作为下游引物,按3′RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3′末端cDNA的快速扩增,成功获取837bp的3′-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%~72.0%)。因此认为成功克隆了Oglc13ⅡcDNA的3′末端序列。     

绵羊GDF9基因PCR-SSCP分析

生长分化因子9（GDF9）是由卵母细胞分泌的一种生长因子,它对早期卵泡的生长和分化起重要的调节作用。采用PCR－SSCP技术分析了GDF9基因在小尾寒羊、湖羊、多赛特羊和萨福克羊4个绵羊品种的多态性。结果表明：GDF9基因在两对引物扩增片段中均存在PCR－SSCP多态性。对于引物1扩增片段,4个绵羊品种均检测到AA基因型,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在萨福克羊中检测到BB基因型;在4个绵羊品种中,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。对于引物2扩增片段,4个绵羊品种均检测到AA基因型,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中,4个绵羊品种均没有检测到BB基因型;在4个绵羊品种中,AA基因型频率最高,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。引物1的多态性片段测序分析表明：位于GDF9基因cDNA第152处发生了单碱基的改变（A→G）,并导致了氨基酸的改变（天冬酰胺→天冬氨酸）。     

应用RACE法克隆鸽恒定链基因的研究

为比较禽类恒定链的结构和功能, 应用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 技术首次克隆并鉴定了鸽恒定链基因。首先用一对含高度保守的DNA片段的简并引物, 从鸽脾细胞RNA扩增部分恒定链片段, 接着测序并设计新引物分别从5′和3′RACE扩增延长该片段。最后根据全基因的序列设计上、下游引物,获得大小为1 050 bp的全长cDNA。比较核苷酸序列, 鸽与鸡的Ii链同源性达到82.8％, 而与人等其它动物的同源性则在52.0％以上; 其中633 bp的开放阅读框编码211个氨基酸残基的前体蛋白。推导和分析氨基酸序列表明, 分子结构与鸡恒定链相似, 其中有些氨基酸残基表现出较高的保守性。     

利用RACE技术扩增大豆抗病基因同源cDNA 5′末端序列

利用抗病基因保守序列筛选大豆cDNA文库,获得一抗病基因同源cDNA片段,命名为KR3-1。根据KR3-1设计两个基因特异引物（GSP 和 NGSP）,分别与通用引物(UPM)和巢式通用引物（NUP）共同扩增,成功地克隆到了该基因的5′末端序列。该扩增片段长447 bp,与已知序列重叠部分为129 bp。 Abstract:Based on part of a known partial cDNA sequence of a disease resistance gene homolog,KR3-1,obtained by screening a cDNA library from soybean,5′-RACE-PCR was carried out with gene specific primers and universal primers.After the nested PCR reaction,an amplified fragment of 447 bp in length which overlapped the known KR3-1 sequence by 129 bp was obtained subsequently.Thus,a 5′ cDNA end of KR3 was successfully cloned.     

多巴胺转运体基因多态性与癌症患者性别关系研究

目的:探讨多巴胺转运体基因(DAT1)多态性与新疆汉族癌症患者性别的关系.方法:采用聚合酶链式反应和VNTR多态性分析技术对新疆汉族癌症患者DAT1多态性进行检测,比较各组间等位基因和基因型频率分布的差异及组内男女性别等位基因和基因型频率分布的差异.结果:在213例无关癌症人群个体中,DATI VNTR多态性表现出6～12倍重复的7种等位基因,共检出7种基因型.男女癌症患者的DATl VNTR等位基因及基因型频率的差异均无显著性(P>0.05).结论:多巴胺转运体基因(DAT1)3'端40bp可变串联重复多态性可能与汉族癌症患者的性别无关.     

应用变性高效液相色谱技术建立胸苷酸合成酶基因多态检测平台

TS基因5′非翻译区(5′ untranslation region, 5′UTR)增强子区域(TS enhancer region, TSER)存在28 bp的2次(2R)、3次(3R)的串联重复多态, 在3R等位基因第二次重复中还存在一个G→C的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs), 同时在3′非翻译区(3′ untranslation region, 3′ UTR)存在6个碱基片段缺失/插入多态。这些多态形式的存在影响了TS基因mRNA的稳定和翻译效率, 并可导致不同TS基因型肿瘤患者对以5-fuorouracil (5-FU)为基础的化疗疗效产生差异。为提高TS基因型临床检测的效率和准确性, 方便、快捷、准确和自动化区分各种纯合及杂合基因型, 设计多重PCR反应, 同时扩增TS基因5′ 和3′ 非翻译区多态所处片段。利用DHPLC技术建立TS基因多态性检测平台, 在非变性条件下, 通过优化DHPLC 洗脱梯度, 同时检测5′ TSER区的串联重复多态和3′ UTR片段长度多态; 在变性条件下, 检测5′ TSER区单核苷酸多态。同时采用PCR-RFLP和DNA 测序方法, 验证DHPLC分析结果。     

褐飞虱肌动蛋白基因3′末端克隆与测序

应用锚定的3′RACE方法,对褐飞虱Nilaparvata lugens (Stal)肌动蛋白基因3′末端进行了扩增、克隆和测序, 并对所得到的5个cDNA片段的不译端的序列进行了比较。结果显示：BPH-A和BPH-D与其他序列不同;BPH-B、BPH-C和PBH-E三条片段的不译端的序列很相似,只是长度不同。另外,所得序列中所含翻译区的氨基酸序列高度保守,根据肌动蛋白基因结构特点可以推断BPH-A和BPH-D属肌肉特异型肌动蛋白基因,BPH-B、BPH-C和BPH-E属细胞质特异型肌动蛋白基因。     

中国畲族群体D17S30位点遗传多态性研究

采用聚合酶链反应 (PCR)技术对中国畲族群体270名无关个体D17S30位点的VNTR进行了研究,共检出12个等位基因,片段大小为168bp-1008bp,基因频率为0.0056-0.3259,杂合度为79.10%,父权排除率为0.4358。家系分析表明,扩增片段按孟德尔方式遗传。统计学分析证明,本资料符合Hardy-W einberg平衡定律(x2=79.97,v=66,P=0.1158>0.05)。 Abstract:The variable number of tandem repeat(VNTR)of D17S30 locus in 270 unrelated individuals of She ethnic group was studied by polymerase chain reaction(PCR).The results showed that 12 alleles were detected and their sizes ranged from 168bp to 1 008bp.The allele frequencies were 0.0056~0.3259,the heterozygosity of this locus was 79.10% and the paternity exclusion probability was 0.4358.The number of D17S30 VNTR allele and allele frequency of She were different from those of Han ethnic group in Mendelian Law.Statistical analysis demonstrated that their geneotypes were consistent with Hardy-Weinberg equilibrium(x2=79.97,v=66,P=0.1158>0.05).     

核质互作型水稻线粒体不育基因的RAPD分析

采用RAPD对水稻Ⅱ-32A、Ⅱ－32B、Ⅱ优949的mtDNA进行分析,得到两个特异的扩增片段OPJ18-1000、OPJ18－1400。序列测定两个特异片段全长分别为1068bp和1481bp。Southern杂交结果证明了差异片段的真实性。用OPJ18－1000作探针与Ⅱ－32A、Ⅱ－32B、Ⅱ－优949的mtRNA斑点杂交结果表明,除Ⅱ－32B外,都在转录水平上对水稻雄性不育有一定影响。虽然OPJ18－1400对应的RNA斑点杂交呈阴性,但其DNA序列中存在一个七碱基5′-TTC-CCTC-3′的保守系列。据报道它是atp6基因中同源重组热点区,可促使线粒体基因重组形成嵌合基因,从而对水稻雄性不育的形成起着重要作用。经同源性比较和DNA、RNA杂交证实获得的两个片段是新的与水稻细胞质雄性不育相关的mtDNA序列。