维生素对体外培养人脐带间充质干细胞生长的影响

该实验以人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCM—SCs）为研究对象,探讨维生素A对其体外培养的影响。结果显示,添加维生素A培养后,hUCMSCs仍维持其本身生物学特性,表达其标记基因CD29、CD44和干细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog。维生素A促进hUCMSCs的体外增殖,上调增殖基因PCNA、C-myc和干细胞标记基因Nanog的表达,下调凋亡基因Bch的表达。该研究证明了维生素A具有促进hUCMSCs增殖和维持其干细胞特性的作用,对继续探索hUCMSCs的体外快速增殖和维生素A对hUCMSCs增殖调控的机理具有重要意义。     

人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定简

目的：建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法,并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。方法：收集健康足月产胎儿脐带组织,采用组织块贴壁法进行原代培养,流式细胞仪对其表面标志进行检测,通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定,RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin进行检测。结果：采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞,培养的细胞经流式细胞仪检测,高表达CD29、CD44、CD105、CD106,低表达CD34、CD45;经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞,RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。结论：人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养,具有多向分化潜能,可作为组织工程种子细胞来源。     

人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的:建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法,并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。方法:收集健康足月产胎儿脐带组织,采用组织块贴壁法进行原代培养,流式细胞仪对其表面标志进行检测,通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定,RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin进行检测。结果:采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞,培养的细胞经流式细胞仪检测,高表达CD29、CD44、CD105、CD106,低表达CD34、CD45;经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞,RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。结论:人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养,具有多向分化潜能,可作为组织工程种子细胞来源。     

Nanog基因的功能与调控研究进展

胚胎干细胞的无限增殖能力和亚全能性决定了它在再生医学、新药开发及发育生物学基础研究中具有巨大的应用前景。探索维持胚胎干细胞亚全能性的因子及其网络的调控功能成为胚胎干细胞生物学研究的热点。已研究发现多个与维持胚胎干细胞亚全能性相关的基因如Oct4, Nanog, Sox2等,其中Nanog是2003年5月末发现的一个基因,它对维持胚胎干细胞亚全能性起关键性作用,能够独立于L1F/Stat3维持ICM和胚胎干细胞的亚全能性。几年来,Nanog的生物学功能及其与 Oct4, Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系已有较为深入的研究,并发现多个调控Nanog表达的转录因子,从而进一步明晰Nanog与已知调控胚胎发育的信号通路之间的关系。本文在综述Nanog基因的表达特征和功能的基础上、重点探讨Nanog基因表达调控以及Oct4, Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系,并对未来的研究趋势予以展望。     

Nanog基因的功能与调控

胚胎干细胞的无限增殖能力和亚全能性决定了它在再生医学、新药开发及发育生物学基础研究中具有巨大的应用前景。探索维持胚胎干细胞亚全能性的因子及其网络的调控功能成为胚胎干细胞生物学研究的热点。已研究发现多个与维持胚胎干细胞亚全能性相关的基因如Oct4,Nanog,Sox2等,其中Nanog是2003年5月末发现的一个基因,它对维持胚胎干细胞亚全能性起关键性作用,能够独立于LIF／Stat3维持ICM和胚胎干细胞的亚全能性。几年来,Nanog的生物学功能及其与Oct4,Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系已有较为深入的研究,并发现多个调控Nanog表达的转录因子,从而进一步明晰Nanog与已知调控胚胎发育的信号通路之间的关系。在综述Nanog基因的表达特征和功能的基础上、重点探讨Nanog基因表达调控以及Oct4,Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系,并对未来的研究趋势予以展望。     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的表达为阳性,SSEA1表达为阴性,体外悬浮培养可以形成拟胚体。结论人脐带间充质干细胞可以作为人胚胎干细胞的饲养层细胞,支持其生长,并维持其未分化生长状态。     

人脐带间充质干细胞在Balb/c裸鼠体内的分布情况研究

目的研究人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）在BalB/c裸鼠体内的分布。 方法采用DiR标记hUCMSCs,以MTT法检测标记hUCMSCs体外培养的生长增殖,流式细胞术检测标记hUCMSCs的细胞表型,以诱导分化法检测标记hUCMSCs的成骨、成脂、成软骨诱导分化能力,小动物活体成像法检测DiR标记hUCMSCs尾静脉给药后在小鼠体内的分布情况。采用t检验对测得的hUCMSCs增殖数据进行统计分析。 结果0,24,48,72,96,120 h MTT法测得的DiR标记hUCMSCs吸光度值与未标记组相比差异无统计学意义,DiR标记对hUCMSCs细胞表型没有明显影响,对其成骨、成脂、成软骨多向诱导分化能力没有影响,DiR标记hUCMSCs尾静脉给药后,荧光首先分布于肺脏,随时间逐渐迁移至肝脏和脾脏,最终归巢和分布于肝脏、脾脏和肺脏,荧光强度肝脏>脾脏>肺脏,随时间逐渐减弱,至4周时动物肝脏、脾脏和肺脏仍有荧光存在。 结论DiR标记不影响hUCMSCs体外增殖、细胞表型表达和多向诱导分化能力,DiR标记hUCMSCs尾静脉注射后首先分布在肺脏,存在明显的首过效应,然后逐渐迁移至肝脏和脾脏,主要分布和归巢在肝脏、脾脏和肺脏。     

长期传代培养对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

该课题研究长期体外传代培养对人脐带间充质干细胞重要生物学属性的影响。采用组织块法分离人脐带间充质干细胞,体外反复传代培养后比较第5、10、20代细胞的主要生物学属性:采用细胞计数法与流式细胞仪检测不同代次细胞增殖活性和表面免疫标志物;染色体常规核型分析和微阵列分析检测其基因稳定性;成脂、成骨诱导分化检测其多向分化潜能;定量RT-PCR检测端粒酶反转录基因hTERT的表达; SA-β-gal活性确定细胞老化状态。第5、10、20代脐带间充质干细胞呈现相同的增殖曲线,各代次干细胞的增殖速率无显著性差异。不同培养代次的脐带间充质干细胞表面均呈现CD105、CD90、CD44、CD73高表达, CD19、CD34、CD45及HLA-DR不表达或低表达。基因稳定性分析证实三个代次干细胞均为正常二倍体核型,染色体基因组未发生基因拷贝数缺失、重复和大片段纯合子现象。成脂和成骨分化潜能以及hTERT表达均未见显著性差异。SA-β-gal活性检测显示,随培养代次的增加,脐带间充质干细胞开始呈现衰老征象,尤以第20代明显。体外反复传代长期培养对人脐带间充质干细胞的基本生物学属性、基因稳定性及其多向分化潜能均无显著性影响。过度长期培养有可能导致干细胞老化,活性降低。     

比格犬会厌黏膜来源干细胞的分离培养与生物学特性鉴定

目的:探讨建立喉部黏膜间充质干细胞的分离培养方法,并对其生物学特性进行鉴定,为进一步研究其在喉部瘢痕中形成的作用及喉部组织工程提供参考.方法:以比格犬喉部会厌背侧(舌面)黏膜为研究对象,采用消化培养的方法分离具有间充质干细胞样细胞.选取第3代细胞对其进行生物学特性鉴定,首先利用MTT法检测其增殖活性及克隆形成情况,然后通过流式细胞术检测细胞表面分子标记物CD29及CD34的表达情况,最后应用第3代细胞对其进行成脂肪细胞和成骨细胞分化培养,观察其分化能力.结果:分离培养细胞形态较为一致,绝大多数呈梭形,排列不规则.MTT增殖活性实验及克隆形成试验结果显示,所分离的细胞具有良好的增殖活性和克隆形成率;流式细胞术结果显示,该细胞表达CD29间充质干细胞细胞表面标记物,低表达造血干细胞细胞表面标记物CD34;同时,该细胞诱导分化成脂肪细胞和成骨细胞实验表明,其具有多向分化潜能.结论:从比格犬会厌背侧黏膜分离的细胞具有间充质干细胞样特性,为进一步研究喉部瘢痕形成机制及喉部组织工程提供了技术基础.     

比较两种不同来源间充质干细胞的生物学特性及多向分化潜能

该文旨在比较人脂肪间充质干细胞(hADSCs)和脐带间充质干细胞(hUMSCs)的生物学特性,并鉴定其多向分化潜能。体外扩增培养hADSCs和hUMSCs,绘制细胞生长曲线并计算群体倍增时间,通过细胞集落实验比较两种细胞的增殖能力,流式细胞仪和RT-PCR方法分别检测细胞表面抗原和多能性相关基因的表达,采用成脂、成骨诱导分化试剂盒比较两种细胞的分化潜能。hADSCs和hUMSCs表达CD34、CD44、CD45、CD105的比例分别为2.7% vs 6.2%、92.3% vs 93.4%、1.3% vs 3.1%、99.4% vs 98.0%,均表达Oct4和Nanog基因;生长曲线均呈"S"型,两种细胞的群体倍增时间差异不显著(P0.05);随着代数的增加,两种细胞的增殖能力均变弱,但P7的hADSCs的增殖能力要显著优于hUMSCs(P0.05);经油红O、茜素红染色及RT-PCR和细胞免疫荧光方法检测特异基因的表达,表明两种细胞均具备成脂、成骨分化的能力,hADSCs的成脂能力优于hUMSCs,但两种间充质干细胞的成骨分化能力没有显著性差异。hADSCs和hUMSCs具有相似的生物学特性,但hADSCs可能具备更强的增殖能力和成脂分化潜能。     

胎盘间充质干细胞的体外培养及其生物学特性研究

目的：探讨胎盘间充质干细胞（PMSCs）的体外分离和培养方法,建立稳定的PMSCs体外培养扩增体系。方法：将胎盘组织经胶原酶消化、密度梯度离心、贴壁筛选法分离,获得并培养人PMSCs,观察细胞形态及其超微结构;应用流式细胞术测定细胞周期及CD14、CD29、CD34、CD44、CD45的表达,研究其增殖和生长特性。结果：在体外培养条件下,人PMSCs贴壁生长,为成纤维细胞样,与骨髓间充质干细胞相似;CD14/CD34/CD45阴性,CD29/CD44阳性,核浆比大,细胞周期检测G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。结论：体外获得的PMSCs形态单一、生长稳定、增殖能力较强,具有与骨髓间充质干细胞相似的细胞形态、表面标志。由于其来源方便、丰富,无伦理学限制,因此可进一步用于细胞治疗的研究。     

非贴壁微球体培养法分离T-淋巴细胞瘤干细胞及鉴定

通过非贴壁微球体无血清培养法,体外构建并鉴定了T-淋巴细胞瘤干细胞。采用细胞球悬浮培养方法富集T-淋巴细胞肿瘤干细胞,利用抑制分化作用的抑制剂CHIR99021和PD173074(2i)进行肿瘤干细胞的筛选,采用RT-PCR法检测Sox2、Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1、C-Myc干细胞特征基因的表达,进一步采用Western blot验证Oct4蛋白水平表达,流式细胞术分析CD34、CD44抗体表达情况,用PI检测细胞周期,用CFSE观察细胞增殖能力,并将富集的T-淋巴细胞肿瘤干细胞进行裸鼠异体移植实验。在细胞球悬浮培养法基础上,利用具有抑制分化作用的抑制剂CHIR99021和PD173074,成功富集出Hut-102干细胞球。经RT-PCR鉴定,Hut-102干细胞球的其干细胞特征基因Sox2、Oct4、Nanog、Klf4、Bmi1、C-Myc表达均显著性高于Hut-102细胞并且高表达Oct4蛋白;经流式细胞术分析CD34、CD44抗体表达,有74.20%的Hut-102干细胞球表现为CD34+,有90.82%的Hut-102干细胞球表现为CD44+,证明抑制分化药物应用于细胞球悬浮培养方法中,能够有效富集出具有CD34+CD44+表型特征的Hut-102干细胞球;用PI检测细胞周期,富集的Hut-102干细胞球中处于G1/G0期的细胞为64%,处于S期的细胞为30.56%,表明该细胞暂不增殖或处于休止状态;用CFSE检测到富集的Hut-102干细胞球分化增殖能力显著高于Hut-102细胞。在NON/SCID裸鼠中,分别移植Hut-102细胞球和Hut-102细胞,结果显示,前者检测到67.74%±5.32%的淋巴细胞表达Hut-102细胞特异性标记物(CD3),而后者的裸鼠中未检测到,说明Hut102细胞球在NON/SCID裸鼠体内表现了T-淋巴细胞肿瘤干细胞特点和移植能力。首次在传统的非黏连微球体无血清培养法中加入两种抑制剂(CHIR99021和PD173074),富集出大量的微球体,通过干细胞特征鉴定及裸鼠移植实验,证明Hut-102细胞球具有T-淋巴细胞肿瘤干细胞特性。     

猪骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的:建立猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)体外分离培养、纯化和鉴定的方法,为下一步实验研究奠定基础.方法:采用密度梯度离心法获得骨髓单核细胞,接种后形成单层贴壁的成纤维样细胞.免疫荧光及PCR检测细胞表面标志及多能性基因的表达,并鉴定分离细胞的多向诱导分化潜能.结果:体外培养的原代细胞10天达到融合,传代后仍具有成纤维样的形态;免疫荧光结果见波形蛋白(Vimention)和Oct4标记阳性,CD45阴性;PCR分子检测见多能性基因OCT-4,nanog的表达;细胞具有分化为成骨细胞和成脂细胞的能力.结论:采用密度梯度离心法获得的pMSCs体外增殖能力强,纯度高,具有间充质干细胞的特性,pMSCs分离培养体系的成功建立为下一步实验研究奠定基础.     

Nanog、Oct-4、Sox-2基因在3种间充质干细胞中的表达

本研究通过体外传代培养人胎盘(placenta mesenchymal stem cells, PA-MSCs)、脐带(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)以及脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells, AD-MSCs),对3种细胞的细胞形态、生长能力、细胞周期及表面标志物进行了检测,同时检测了多能维持基因Nanog、Oct-4和Sox-2的基因表达水平,以探讨其表达量对3种间充质干细胞细胞干性维持能力的影响。结果表明:在3种细胞的传代过程中,PA-MSCs和UC-MSCs的增殖活性明显高于AD-MSCs;随着传代次数的增加,在PAMSCs中,Nanog和Sox-2表达较为稳定,而Oct-4的表达不稳定;在UC-MSCs及AD-MSCs中,3种基因表达水平均表现出较大的差异。因此,研究人员推测PA-MSCs多能性维持能力强于UC-MSCs及AD-MSCs。     

阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞体外分离培养及鉴定

探讨阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞(Arbas cashmere goat bone marrow-derived mesenchymal stem cells,g BMMSCs)体外分离培养,并对其生物学特性进行系统的鉴定,进一步深入分析体外诱导时多向分化相关基因动态表达情况。结果显示,原代培养的g BM-MSCs呈梭形或纺锤形、放射状排列的细胞集落,能够连续稳定传代至15代以上;免疫荧光及流式细胞术检测显示,g BM-MSCs表达间质系特异性表面标志物,如:CD13、CD29、CD44、CD106、CD90及CD166,不表达造血干细胞表面标志物CD45及CD34;体外诱导实验证实该细胞具有多向分化潜能,能够向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化;荧光定量PCR实验结果显示,g BM-MSCs多向分化相关基因的表达水平随着诱导天数的增加呈上升趋势。实验结果证实阿尔巴斯绒山羊骨髓中分离培养的细胞具备g BM-MSCs的生物学特性。     

人诱导多能干细胞与人胚胎干细胞分化过程中Oct4/Nanog 基因 表达的比较

目的:比较通过慢病毒方法获得的人诱导多能性干细胞(iPSCs)与人胚胎干细胞(hESCs)分化过程中全能性基因Oct4、Nanog的表达变化。方法:收集分化不同时间点的拟胚体(EBs),检测三胚层分化基因以及全能性基因Oct4/Nanog的表达,并通过畸胎瘤组织切片的荧光染色分析Oct4的表达。结果:iPSCs获得的EB中内外三胚层分化基因表达的出现明显晚于hESCs来源的EB。不同于hESCs,iPSCs悬浮培养获得的EBs在体外培养18天未见内源性Oct4、Nanog基因表达的下调。未分化的iPSCs注射严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠培养10周后获得的畸胎瘤中仍存在Oct4阳性的细胞,但iPS-#2中明显少于iPS-#5。结论:通过慢病毒方法获得的iPSCs虽然具有向三胚层分化的能力,但在分化过程中仍维持较高水平的全能性基因Oct4、Nanog的表达。     

人诱导多能干细胞与人胚胎干细胞分化过程中Oct4/Nanog基因表达的比较

目的：比较通过慢病毒方法获得的人诱导多能性干细胞（iPSCs）与人胚胎干细胞（hESCs）分化过程中全能性基因Oct4、Nanog的表达变化。方法：收集分化不同时间点的拟胚体（EBs）,检测三胚层分化基因以及全能性基因Oct4/Nanog的表达,并通过畸胎瘤组织切片的荧光染色分析Oct4的表达。结果：iPSCs获得的EB中内外三胚层分化基因表达的出现明显晚于hESCs来源的EB。不同于hESCs,iPSCs悬浮培养获得的EBs在体外培养18天未见内源性Oct4、Nanog基因表达的下调。未分化的iPSCs注射严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠培养10周后获得的畸胎瘤中仍存在Oct4阳性的细胞,但iPS-#2中明显少于iPS-#5。结论：通过慢病毒方法获得的iPSCs虽然具有向三胚层分化的能力,但在分化过程中仍维持较高水平的全能性基因Oct4、Nanog的表达。     

鸭脂肪间充质干细胞分离培养与生物学特性

建立禽类脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外培养体系,探索其生物学特性和多分化潜能。通过酶消化法分离18日龄鸭胚ADSCs,绘制生长曲线,通过RT-PCR、免疫荧光和流式细胞术阳性率检测对ADSCs进行鉴定,诱导ADSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化。结果表明,鸭胚胎ADSCs体外增殖能力良好;阳性表达CD29,CD44,CD105,表达率分别为95.39%、94.53%和98.19%;经体外诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。研究认为在适宜的培养条件下,体外培养的ADSCs能够稳定增殖并具有多分化潜能,可作为组织工程的种子细胞进行保存。     

建立人源A2B5+/CD133–的胶质瘤亚群干细胞样细胞株的实验研究

胶质细胞瘤(GBM)是人类最常见的原发性脑肿瘤,并且是人类癌症中最致命的肿瘤之一。目前学术界普遍认为,胶质瘤细胞的异质性和耐药性一定程度上归因于胶质瘤干细胞样细胞的存在。该研究通过对胶质瘤组织进行原代培养、分选纯化、单克隆法成功建立A2B5+/CD133–胶质瘤细胞株SHG-ZW,再干细胞逆转培养成胶质瘤干细胞样细胞株SHG-ZWs。细胞免疫荧光检测SHG-ZWs显示,其高表达干性标记物A2B5、nestin、Sox2等,不表达CD133;体外二次球体形成表明,SHG-ZWs可以在体外进行自我更新,不断增殖;诱导分化后行免疫荧光,检测到SHG-ZWs可向神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化;裸鼠体内移植瘤实验显示,SHG-ZWs具有成瘤性。该研究表明,可通过分选纯化、单克隆法从实体肿瘤中建立稳定传代的A2B5+/CD133–胶质瘤干细胞样细胞株,为胶质瘤干细胞样细胞的研究、人源GBM肿瘤组织原代培养以及胶质瘤干细胞样细胞的靶向性治疗提供细胞工具。     

转染hTERT基因的大鼠神经干细胞生物学特性的研究

目的 本试验旨在研究hTERT基因所表达的蛋白对NSCs生物学特性的影响。方法 本试验通过脂质体转染法将构建的重组质粒pEGFP-N1-hTERT转染到大鼠胎儿NSCs中,对转染的NSCs进行体外诱导分化试验、裸鼠致瘤性试验、RT-PCR、Western-blot和流式细胞仪分析。结果 转染的NSCs在体外培养中仍具有干细胞的生长特性和多潜能性、无致瘤性,转染重组质粒的NSCs中,存在hTERT基因mRNA的转录产物和融合蛋白hTERT-GFP的表达。结论 hTERT基因对神经干细胞端粒酶活性有上调作用,可促进NSCs的体外增殖和永生化趋势。