重组 E.coli 解旋酶Ⅱ（UvrD）的DNA结合及解螺旋功能分析

E.coli 解旋酶Ⅱ（UvrD）是一种在甲基定向错配修复（methyl-directed mismatch repair, MMR）和核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）中起重要作用的3′→5′解旋酶.本研究对大肠杆菌的UvrD进行了重组表达和纯化,并检测其ATP酶比活性（87　U/mg）. 利用表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）方法实时检测了UvrD与同源双链DNA分子（homoduplex DNA）和异源双链DNA分子（heteroduplex DNA）结合的动态过程以及镁离子对此过程的影响.结果显示,UvrD与DNA的平衡解离常数在10 ^－7mol/L 水平. DNA分子中错配碱基的存在,在一定程度上影响了二者的结合,而镁离子不是两者结合的必要因素.本研究还利用原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）方法在单分子水平上观察到UvrD将双链DNA解链形成单链DNA的中间体.此研究得到的UvrD与DNA结合的动力学信息数据以及解螺旋中间体的单分子可视化,为进一步深入研究UvrD在修复过程中的作用机制奠定了基础.     

苔藓植物分子系统学研究概况

结合同工酶分析技术及随机扩增多态性DNA（RAPD）、限制性片段长度多态性（RFLP）和DNA序列测序3种分子生物学技术,对苔藓植物的分子系统学研究概况进行了介绍,并指出了在苔藓植物分子系统学研究中存在的一些问题。     

黑藻cpDNA分子标记的筛选及其遗传多样性的初步研究

本研究从18个叶绿体DNA（cpDNA）分子标记中筛选出3个有效分子标记trnL-trnF、trnH-psbA和RPL16,利用它们对中国黑藻（Hydrilla verticillata（L.f.）Royle）8个居群进行了遗传多样性研究。结果显示,黑藻8个居群40个样本共有12个单倍型,总变异位点数为135个;单倍型多样性指数为0.9064,遗传多样性主要存在于居群间（89.6%）。其中单倍型Hap4同时存在于地理距离相隔较远的陕西汉中（SXHZ）和浙江余姚（YY）居群中。研究结果表明黑藻可以通过无性繁殖的方式快速完成居群扩张,同时,地理隔离和生境差异可能导致居群间基因流较低,奠基者效应和遗传漂变可能对黑藻的遗传结构产生重要影响。     

DNA分子标记在实验动物遗传分析中的应用

DNA分子标记技术很多,基本都是建立在RFLP、PCR和重复顺序的基础上的。本文重点介绍了限制性片段长度多态性（RFLP）标记、随机扩增多态性DNA（RAPD）标记、微卫星DNA（STR）标记、DNA指纹（DFP）标记、扩增片段长度多态性（AFLP）标记等几种重要的DNA分子标记技术的定义、结构、分布、组成、保守性、优点及丰富的多态性等。并重点介绍了微卫星DNA（STR）标记在分子遗传监测、遗传多样性分析和遗传血缘关系及个体识别等领域的应用。     

单分子PCR技术及其应用

常规PCR技术大都以大量DNA分子(一般为105个以上)为模板进行DNA扩增。新近发展起来的单分子PCR技术是一种以极少量DNA分子(1、5或10个分子)为模板进行扩增的技术。在高保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术能扩增出高度一致的DNA;在低保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术又能构建出含有大量突变基因的DNA库。该将介绍单分子PCR的基本原理、实验步骤、特点及其应用。     

DNA复制研究步入单分子时代

DNA复制是生命体内必不可少的基本过程之一。传统研究显示DNA复制体中前导链和后随链的合成速度总体来说是一致的,从而避免在新生链中产生明显的单链缺口。主流的观点认为这是由于负责前导链和后随链的两个DNA聚合酶分子之间存在着某种协调同步机制。然而,Kowalczykowski实验室最近采用单分子荧光显微技术实时跟踪发现,大肠杆菌DNA复制体前导链和后随链上两个DNA聚合酶分子互相独立工作,并且都不是匀速行进而是呈现断断续续、时快时慢的随机动态变化。当DNA聚合酶暂停复制时,解旋酶仍会持续解链,导致解旋酶和聚合酶短暂的分离。有意思的是,此时DNA复制体触发一种类似“死人键”(dead-man’s switch)的保险机制,使DNA解旋的速度降低80%,从而恢复解旋酶和聚合酶的偶联。基于单分子水平的实时观察,他们认为前导链和后随链DNA复制进程均遵循一个符合高斯分布的随机模型。这与传统的生化研究观察到两者的合成速度总体来说是一致的并不矛盾。Kowalczykowski实验室的研究实现了从复制开始到结束整个过程对每个单分子行为的连续观测,而传统研究反映的则是经过较长时间对多分子群体平均水平的最终结果进行测定。因此,单分子技术可以极大地弥补传统生化研究的不足。随着未来单分子技术的进步和更广泛的应用,必将把包括DNA复制在内的生物学研究带到一个新的时代。     

DNA单分子近场光学成像与荧光探测

介绍了扫描近场光学(SNOM-Scanning Near-Field Optical Microscope)／原子力显微镜（AFM－Atomic Force Microscope)系统（SNO／AM）的工作原理。在AFM模式和SNOM模式下对DNA分子进行成像和荧光探测,得到了清晰的DNA单分子的形貌像和荧光像。由形貌圆像得到的DNA分子尺寸横向为20nm,高度为2nm,其中包含了探针形貌的影响。实验中采Tapping模式的AFM成像,样品经多次搜索扫描无明显损坏。AFM模式的分辨率优于1nm。SNOM模式下DNA分子形貌像和荧光像清晰,由近场荧光分布可以确定分子取向和浓度。用YOYO－1染料对λDNA分子进行染色和荧光探测。通过对DNA分子多个截面进行测量,分析染料 与DNA结合状态。     

酶的定向进化及其应用

综述了生物催化剂（酶）分子定向进化的产生、原理、方法及应用,深入阐述酶分子定向进化过程中的相关问题,重点介绍了易错PCR（Error-prone PCR）和DNA改组（DNA shuffling）等几种典型的酶定向进化方法与成功实例,展望了生物定向进化研究的发展前景。     

单分子荧光共振能量转移技术

单分子荧光共振能量转移技术（single molecule fluorescence resonance energy transfer,smFRET）通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率,来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发展之前,大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应（ensemble averages）,这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究,得到某一分子特性的分布状况,也可研究生物分子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。     

粟酒裂殖酵母染色体DNA的脉冲电泳分析

采用等高锁状均质电场（CHEF）凝胶电泳技术,对来自中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）菌株AS2.214进行染色体DNA分析。CHEF电泳结果显示菌株AS2.214的4条染色体DNA的分子大小分别约为5900kb、3200kb、2500kb和550kb,基因组大小约为12000kb。供试菌株AS2.214第Ⅰ条染色体DNA为5900kb与已研究报道的菌株972h和HM248（5700kb）的基本一致,第Ⅱ条染色体DNA（3200kb）和第皿条染色体DNA（2500kb）,分别较上述2个菌株约小1400kb和1000kb,第Ⅳ条染色体DNA的分子大小与部分非整倍体菌株HM248的极微染色体Ch16DNA相近（500kb）。研究结果表明粟酒裂殖酵母菌株间染色体DNA长度存在显著差异,菌株AS2.214可能是三倍体减数分裂所产生的稳定的部分非整倍体。     

云南地区恒河猴线粒体DNA控制区遗传多态性研究

目的从分子水平探讨云南地区恒河猴遗传多样性,为今后开展恒河猴遗传资源的保护及合理利用提供借鉴和背景资料。方法采用PCR直接测序法测定云南地区恒河猴96份样品的线粒体DNA控制区全序列,用Mege 4.0和DNA SP软件对变异位点数、简约信息位点数、单倍型、单倍型多样度、核苷酸多样度等遗传信息进行分析,基于邻接法（neighbor-joining,NJ）和最小进化法（minimum-evolution,ME）构建系统发生树。结果在96份样品中,共检测出了149个多态性位点,定义了46种单倍型,单倍型多样度（Hd）为0.968±0.007,核苷酸多样度（Pi）为0.020。结论云南地区恒河猴存在着较丰富的遗传多态性。     

遗传标记及其在作物品种鉴定中的应用

本文评述了用于作物品种鉴定的形态标记（morphological markers）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（biochemical markers）、分子标记（molecular markers）的优缺点。重点评述了分子标记在作物品种鉴定中的应用。文中除对蛋白质电泳指纹图谱——同工酶和贮藏蛋白（包括醇溶性蛋白、清蛋白、谷蛋白、球蛋白等）电泳产生的指纹图谱的应用外,较详细地介绍了近年来DNA指纹图谱技术;包括限制片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,简称RFLP）、随机扩增多态性DNA (random amplified po lymorphic DNA,简称RAPD)、小卫星DNA（minisatellite DNA）、微卫星DNA（microsatellite DNA）,简单重复序列间扩增（intersimple sequence repeats,简称ISSR）,扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,简称AFLP）以及CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences)和SNPS (single nucleotide polymorphisms)对作物品种鉴定和新品种登记,品种纯度和真实性的检验以及品种间亲缘关系的探讨和在分类研究中的贡献等。     

用于金刚石表面单分子有序固定的DNA折纸制备

近年来兴起的以金刚石氮-空位(NV)色心为量子传感器的微观磁共振技术得到快速发展,已经实现单个生物分子磁共振谱的探测,正在向单分子结构和功能的研究推进.这其中需要解决一个重要的技术问题,即单分子在金刚石表面的有序分散和固定. DNA的自组装为解决这一问题提供了可行途径,本文使用DNA折纸技术,制备了一种60 nm边长的正方形双层DNA折纸作为单分子载体,并与金刚石表面结合.首先采用双层结构提高了DNA折纸的稳定性,其次通过在DNA折纸边缘添加发卡结构减少了DNA折纸结构间的聚团,最终成功将DNA折纸装配到金刚石表面.通过原子力显微镜图像进行表征显示其结构完整、分散均匀.本工作为后续的单分子磁共振技术在单分子生物物理领域的应用推广奠定了样品制备的基础.     

单分子装置：传感器、连接器、致动器

生物大分子之所以可以实现生物学功能是与其独特的力学性质息息相关的。作为纳米科技领域一个重要工具,原子力显微镜（AFM）可以对纳米尺度的生物大分子进行操纵并检测其力学性质。本文介绍了利用原子力显微镜对几类特殊蛋白以及DNA的力学性质的研究结果,发现这些生物分子具有很好的力学传感、连接和致动能力,将来有望作为单分子装置在纳米世界发挥更多功用。     

DNA指纹技术在污染土壤生态毒理诊断中的应用

生物标记物能在细咆或分子水平上指示暴露．效应关系,是进行污染土壤生态毒理诊断的主要技术手段之一。随着分子生物学技术的飞速发展,出现了一系列以聚合酶链式反应为基础的、在分子水平上检测污染物质导致的生物体DNA损伤的DNA指纹技术。DNA指纹技术的主要类型有：随机扩增多态性DNA（RAPD）、聚合酶链式反应．单链构象多态性（PCR-SSCP）、扩增片段长度多态性（AFLP）、任意引物聚合酶链式反应（AP—PCR）、差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT）、短DNA重复序列（SSR）及限制片段长度多态性（RFLP）等。这些技术与检测基因突变、染色体畸变和损伤为主的一系列经典研究方法如彗星分析、微核实验等相比具有简便、快速、灵敏等优点。本文着重介绍了随机扩增多态性DNA、聚合酶链式反应．单链构象多态性、扩增片段长度多态性3种重要的DNA指纹技术在污染土壤诊断中的应用。     

碱性磷酸单醋酶在DNA体外重组试验中的应用

在遗传工程中,目的基因与载体DNA进 行连接反应时,为确保这些DNA与载体重组成 功,通常需加人数倍于目的基因的载体DNA, 但是,大量加人载体DNA,由于连接反应使大 多数DNA分子自身环化［[31,在转化时产生大量 不含目的基因的转化子,而含重组DNA的转 化子则很少,需筛选大量菌落,才能得到含有重 组DNA的转化子,这样,载体的自身环化给筛 选工作带来很大的工作量。Ullich等141介绍了 一种减少载体DNA自身环化的简单方法,就是 用碱性磷酸单醋酶切除掉载体DNA 5’末端的 磷酸基151,然后再进行体外重组。经这样处理 后的载体分子,由于缺少连接酶作用的底物（5’ 磷酸基）,分子之间不能相互连接,但其3‘末端 的经基可与未脱磷的外源DNA连接成缺口环 状型的重组DNA分子。采用这种方法可以大 大减少筛选时的工作量,所以碱性磷酸单醋酶 在DNA体外重组中的应用日趋广泛。我们选 用质粒四R325为模式,用细菌碱性磷酸单醋酶 处理后,转化Ecoli RRI,获得了较为满意的 结果。我们采用此法顺利地完成了国内乙型肝 炎病毒基因组与pBR325的重组工作。     

分子标记及其在海洋动物遗传研究中的应用

分子遗传标记在农业动植物育种和生产上得到了广泛的应用,且取得了可喜的成果,但在水生生物上的应用还处于初始阶段。本文简要介绍了限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、小卫星DNA和微卫星DNA（或称简单序列重复,SSR）等分子标记的概念、基本原理及其特点,重点介绍了第三代分子标记单核苷酸多态性（SNP）技术。综述了这些分子标记在海洋动物遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传图谱的构建和标记辅助育种等方面的应用。     

小波变换及滚球算法在单分子荧光能量共振转移图像分析中的应用

单分子荧光共振能量转移技术是通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率来研究分子构象的变化．要得到这些生物大分子的信息就需要对大量的单分子信号进行统计分析,人工分析这些信息,既费时费力又不具备客观性和可重复性,因此本文将小波变换及滚球算法应用到单分子荧光能量共振转移图像中对单分子信号进行统计分析．在保证准确检测到单分子信号的前提下,文章对滚球算法和小波变换算法处理图像后的线性进行了分析,结果表明,滚球算法和小波变换算法不但能够很好地去除单分子FRET图像的背景噪声,同时还能很好地保持单分子荧光信号的线性．最后本文还利用滚球算法处理单分子FRET图像及统计15 bp DNA的FRET效率的直方图,通过计算得到了15 bp DNA的FRET效率值．     

荧光单分子检测技术在生命科学中的应用

荧光单分子检测技术是用荧光标记来显示和追踪单个分子的构象变化、动力学,单分子之间的相互作用以及单分子操纵的研究。过去对于生命科学分子机制的研究,都是对分子群体进行研究,然后平均化来进行单分子估测。因此,单个分子的动态性和独立性也被平均化掉而无法表现出来。荧光单分子检测技术真正实现了对单个分子的实时观测,将过去被平均化并隐藏在群体测量中不能获得的信息显示出来。近几年来,荧光单分子检测技术的飞速发展,为生命科学的发展,开辟了全新的研究领域。现就荧光单分子检测技术在研究动力蛋白、DNA转录、酶反应、蛋白质动态性和细胞信号转导方面的应用进展作一综述。     

核rDNA ITS区序列在无脊椎动物分子系统学研究中的应用

在无脊椎动物的分子系统学研究中,作为对线粒体DNA信息的重要补充,人们越来越多采用核DNA的核糖体内转录间隔区（ITS）作为分子标记。本文介绍了ITS的组成和性质,并对近年来ITS在无脊椎动物分子系统学研究中的应用进行了总结,同时提出并讨论了目前在该领域存在的一些问题。