马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建

在已有全长感染性克隆pLGFD3-8和pD70344的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换.将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT-PCR方法及Real-time RT-PCR验证其感染性.结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性.电镜下可见大量典型的EIAV颗粒.pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8具有相似的复制水平,pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞.此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础.     

逆向突变型EIAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

在已有全长基因组感染性克隆 pLGFD3 8的基础上,按照疫苗制作过程中 EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造。并在gag突变的基础上增加env 突变位点。将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和 RT PCR方法验证其感染性。结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到 RT酶活性和 RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的病毒颗粒。然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度。驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后。此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础。     

逆向突变型ELAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

在已有全长基因组感染性克隆pLGFD3-8的基础上,按照疫苗制作过程中EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造。并在gag突变的基础上增加e一突变位点。将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和RT-PCR方法验证其感染性。结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性。电镜下可见大量典型的病毒颗粒。然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度。驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后。此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础。     

逆向突变型EIAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

在已有全长基因组感染性克隆pLGFD3-8的基础上,按照疫苗制作过程中EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造.并在gag突变的基础上增加env突变位点.将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和RT-PCR方法验证其感染性.结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性.电镜下可见大量典型的病毒颗粒.然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度.驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后.此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础.     

特异性标记EIAV感染性克隆的构建及鉴定

用FLAGTM或6 His对EIAV疫苗株全基因感染性克隆pFD3的S2分子进行分子标记,以建立EIAV疫苗株与野毒株感染鉴别诊断的方法.标记产物pFD3-FLAG和pFD3-HISADD转染驴胎皮细胞 (FDD)后收获衍生病毒并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性. 在FDD细胞上盲传至第五代后收获细胞培养上清再感染驴单核巨噬细胞 (DL),盲传三代后pFD3-FLAG RT酶活性显示弱阳性,未见明显的细胞病变;pFD3-HISADD为强阳性,且细胞病变效应明显,在电镜下可见明显的病毒颗粒.与父本克隆pFD3相比,在细胞水平上二者复制特性有明显的不同.证明在DL细胞上S2基因的完整性是病毒复制很重要的因素.     

特异性标记EIAV感染性克隆的构建及鉴定

用FLAG^TM或6His对EIAV疫苗株全基因感染性克隆pFD3的S2分子进行分子标记,以建立EIAV疫苗株与野毒株感染鉴别诊断的方法。标记产物pFD3-FLAG和pFD3-HISADD转染驴胎皮细胞(FDD)后收获衍生病毒并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性。在FDD细胞上盲传至第五代后收获细胞培养上清再感染驴单核巨噬细胞(DL),盲传三代后pFD3-FLAGRT酶活性显示弱阳性,未见明显的细胞病变;pFD3-HISADD为强阳性,且细胞病变效应明显,在电镜下可见明显的病毒颗粒。与父本克隆pFD3相比,在细胞水平上二者复制特性有明显的不同。证明在DL细胞上S2基因的完整性是病毒复制很重要的因素。     

感染性马传染性贫血病毒嵌合克隆的构建

在已有的全长感染性克隆pFD3的基础上,构建了新的低拷贝的全长克隆pLGFD3-8。按照疫苗制备过程中env基因的变化情况,采用基因替换和定点突变的方法,构建了一系列具有马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株env基因及其主要突变特征的嵌合克隆。利用这些克隆转染FDD细胞,并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性。结果发现,在FDD细胞中传代3次后,可在细胞培养物中检测到逆转录酶活性和原病毒DNA的存在,在电镜下可以观察到典型的EIAV病毒颗粒。这一结果为进一步研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和免疫保护机理奠定了良好的基础。     

中国株EIAV S2基因逆向突变感染性克隆的构建及体外感染性评价

以中国株EIAV的驴强毒株EIAVDV115与疫苗株EIAVFDDV15的S2基因变化规律为依据,利用反向遗传技术对EIAV弱毒疫苗株全基因组感染性克隆pFDDV3-8的S2基因区进行逆向突变,构建了含有强毒株EIAVDV115S2基因区内4个稳定点突变的克隆质粒pFDDVS2r1-3-4-5,将该质粒转染FDD后进行体外继代盲传,经RT-PCR、逆转录酶活性、间接免疫荧光等检测后,显示经EIAV克隆质粒pFDDVS2r1-3-4-5转染的FDD盲传3代后,可在转染的FDD细胞培养物的上清液中检测到EIAV逆转录酶活性;该细胞培养物经RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈EIAV阳性;在电镜下可观察到典型EIAV粒子。证明已成功拯救经EIAVS2基因逆向突变后的衍生病毒vpFDDVS2r1-3-4-5。比较vpFDDVS2r1-3-4-5衍生病毒与亲本克隆衍生病毒的复制动力学,表明前者的复制比后者略滞后。以上结果提示,对疫苗株S2基因的突变未明显影响EIAV的体外复制。     

马传染性贫血病毒N-连接糖基化回复突变的感染性克隆构建

根据马传贫强毒株EIAV-L和疫苗株EIAV-FDD表面蛋白gp90的N-连接糖基化的变化规律,采用PCR定点突变的方法,对全长感染性克隆pLGFD3-8上的N-连接糖基化的差异区域进行改造后,构建成含有3个N-连接糖基化位点突变的感染性克隆pLGNl91N236N246.将其转染驴胎皮肤细胞(FDD),通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性.结果表明,在FDD细胞中盲传三代后,在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性,RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性,电镜下见到典型的EIAV颗粒.这一结果可能对N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础.     

马传染性贫血强/弱毒嵌合病毒的体外构建

马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)引起马传染性贫血(简称马传贫),导致马持续性感染和反复病毒血症[1].EIAV与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性[2].在反转录病毒前病毒基因组两端含有长末端重复序列(long terminal repeat,LTR).LTR含有真核启动子,其中含有病毒转录调控顺式作用位点,病毒编码的反式作用因子与其结合后可以反式激活基因的表达,对病毒基因的表达和其它生命活动起重要调控作用[3,4].因此,LTR序列的变异可能会引起病毒转录和复制方式的改变,进而引起其细胞嗜性和致病性的改变[5,6].为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,用EIAV强毒L株LTR置换了以前构建的EIAV DLA(弱毒)感染性分子克隆中的LTR,构建了马传贫强/弱毒嵌合分子克隆,并获得了具有感染性的强/弱毒嵌合病毒.     

马传染性贫血病毒非编码区LTR嵌合克隆的生物学特性

将已构建的马传染性贫血病毒LTR强弱毒嵌合克隆衍生毒vLGFD9-12体内接种健康试验马,在150d观察期内,各组试验动物体症均未见异常。血液学分析发现,vLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与亲本弱毒疫苗株的白细胞与血红蛋白含量总体上没有明显的规律性的变化。在动物外周血中均检测到一定的病毒RNA拷贝数,但拷贝数较低。二者在诱导EIAV特异性淋巴细胞增殖功能和特异性细胞毒性杀伤反应中,亦具有相似的变化趋势和效应。本项研究为进一步确定我国马传贫弱毒疫苗株毒力致弱及免疫保护的分子机制奠定了重要的分子生物学基础。     

Enhanced sensitivity to neutralizing antibodies in a variant of equine infectious anemia virus is linked to amino acid substitutions in the surface unit envelope glycoprotein.

Serial passage of the prototype (PR) cell-adapted Wyoming strain of equine infectious anemia virus (EIAV) in fetal donkey dermal (FDD) rather than fetal horse (designated fetal equine kidney [FEK]) cell cultures resulted in the generation of a variant virus strain which produced accelerated cytopathic effects in FDD cells and was 100- to 1,000-fold more sensitive to neutralizing antibodies than its parent. This neutralization-sensitive variant was designated the FDD strain. Although there were differences in glycosylation between the PR and FDD strains, passage of the FDD virus in FEK cells did not reduce its sensitivity to neutralizing antibody. Nucleotide sequencing of the region encoding the surface unit (SU) protein from the FDD strain revealed nine amino acid substitutions compared with the PR strain. Two of these substitutions resulted in changes in the polarity of charge, four caused the introduction of a charged residue, and three had no net change in charge. Nucleotide sequence analysis was extended to the region of the FDD virus genome encoding the extracellular domain of the transmembrane envelope glycoprotein (TM). Unlike the situation with the FDD virus coding region, there were minor variations in nucleotide sequence between individual molecular clones containing this region of the TM gene. Although each clone contained three nucleotide substitutions compared with the PR strain, only one of these was common to all, and this did not affect the amino acid content. Of the remaining two nucleotide substitutions, only one resulted in an amino acid change, and in each case, this change appeared to be conservative. To determine if amino acid substitutions in the SU protein of FDD cell-grown viruses were responsible for the enhanced sensitivity to neutralizing antibodies, chimeric viruses were constructed by using an infectious molecular clone of EIAV. These chimeric viruses contained all of the amino acid substitutions found in the FDD virus strain and were significantly more sensitive to neutralizing antibodies than viruses from the parental (PR) molecular clone. These results demonstrated that sensitivity to neutralizing antibodies in EIAV can be conferred by amino acid residues in the SU protein. However, such amino acid substitutions were not sufficient to enhance cytopathogenicity, as the chimeric viruses did not cause excessive degenererative effects in FDD cells, as was observed with the parental FDD virus strain.     

马传染性贫血病毒基因组部分转录图谱

以马传贫驴白细胞弱毒和驴强毒分别接种培养细胞和试验动物,分别在体外和体内条件,对病毒的各种转录产物进行克隆和序列分析。通过与病毒基因组的序列进行比较,用实验的方法绘制出了两株病毒在相应试验条件件下的转录图谱,确定了各拼接产物的外显子构成以及拼接供体和拼接受体位点的具体位置。发现两种病毒在外显子－3的上游拼接受体位点（SA2）的位置与已报道的EIAV毒株均不相同,且二者的拼接信号不一致。     

High-Efficiency Rescue of Equine Infectious Anemia Virus from a CMV-Driven Infectious Clone

<正>Dear Editor,Equine infectious anemia virus (EIAV) belongs to the macrophage-tropic lentiviruses family and infects mainly equines, including horses, donkeys and mules. EIAV shares many similar characteristics in its viral biology and hostvirus immune regulation with other lentiviruses, such as human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and simian immunodeficiency virus (SIV), and has been accepted as a     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株酸性蛋白p9基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码p9蛋白的基因,并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白,其氨基端带有6个组氨酸的标签,因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验中,重组的酸性蛋白p9可与马传贫阳性血清样品发生反应,而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性,可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体内免疫应答的研究 。     

拼接信号序列单碱基变异提高马传染性贫血病毒mRNA拼接效率

分别以马传染性贫血(马传贫)驴强毒(D—A EIAV)RNA和马传贫驴白细胞弱毒疫苗(DLA EIAV)RNA为模板,利用RT—PCR的方法,克隆到马传贫强、弱毒株基因组外显子2及其下游的核苷酸序列。然后将报告基因CAT插入到EIAV内含子2env阅读框架中,构成CAT拼接报告系统。同时在强毒株重组表达质粒的基础上,将其外显子-3上游拼接受体位点的核苷酸序列CAG突变为弱毒株相应位置的核苷酸序列TAG,得到强毒单核苷酸突变株重组表达质粒。用构建的3个重组表达质粒DNA转染驴血白细胞,ELISA检测转染细胞CAT浓度。结果表明：EIAV强毒株重组表达质粒中CAT蛋白表达量最高,EIAV强毒株重组表达质粒次之,EIAV强毒突变株重组表达质粒最低。由于CAT基因被插入于各重组质粒中的EIAV内含子-2里,EIAV外显子-2、3之间的拼接可导致该基因的删除,因而其拼接效率低于EIAVmRNA外显子-2、3之间的拼接效率。实验数据表明,EIAV SA2拼接信号序列单碱基变异提高了SD2-SA2拼接效率;D—AEIAV SA2-SD2拼接效率比DLA EIAV相应位点拼接效率高。     

EIAV env基因在痘苗病毒中的表达及其免疫效果的观察

将马传贫驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株env基因克隆到痘苗病毒表达载体pSC65的pE／L启动子下游,通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株基因组TK区,经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv—DINenv和rvv—LNenv,Westem blot检测目的蛋白的表达,结果表明重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Env蛋白,其肌肉接种免疫小鼠后,表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答,其中以细胞免疫效果更为显著,CTL特异性裂解最高可达28％。本研究为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定了基础。