酵母PHO85基因的定点诱变和功能分析

克隆酵母ＰＨＯ８５基因，用ＵＲＡ３基因取代其部分编码序列，通过染色体同源重组的途径，构建ＰＨＯ８５缺失突变株。以细胞内酸性磷酸酯酶的活力水平显示ＰＨＯ８５的功能作用。完整ＰＨＯ８５基因转入缺陷型酵母菌，能使表达回复，位点专一诱变的ＰＨＯ８５基因（Ｇｌｙ１３→ＡＳＰ或ＬＹＳ３３→Ｇｌｕ）丧失此种功能。ＰＨＯ８５与ＣＤＣ２８编码的蛋白激酶有较高的同源性。ＰＨＯ８５的Ｇｌｙ１３和Ｌｙｓ３３相当于蛋白激酶     

酵母PAP1与PHO85激酶复合物对PHO4的磷酸化

酵母ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＡＰ１与其它的ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＨＯ８０、ＰＣＬ１及ＰＣＬ２有较高的同源性。我们上ＰＡＰ１与ＨＡ抗原的融合基因,利用抗－ＨＡ抗体进行免疫沉淀。体外翻译的融合ＨＡ标记肽的ＰＡＰ１与体外翻译的ＰＨＯ８５的免疫共沉淀证明了ＰＡＰ１与ＰＨＯ８５的结合。同时纯化了大肠杆菌表达的ＰＨＯ４蛋白,并构建了Ｐ９ＨＯ８５：：ＰＲＰ１缺失株。ＰＡＰ１与ＨＡ的融合基因被置于酵母ＡＤＨ１启动子的控     

酵母转录因子PHO81锚蛋白重复序列表达和功能分析

酵母转录因子ＰＨＯ８１蛋白含有６个锚蛋白重复序列。将ＰＨＯ８１锚蛋白重复序列与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合表达（ＧＳＴ－ＡＮＫ）,表达产物以包含体形式存在。利用氧化型和还原型谷城肽系统对包含体进行复性,得到了可溶性蛋白,亲和纯化后,进行了活性分析。通过免疫共沉淀、分别制备了ＰＨＯ８５－ＰＨＯ８０和ＰＨＯ８５－ＰＡＰ１激酶复合物,用重组的ＰＨＯ４蛋白作底物,在激酶反应体系中加入ＧＳＴ－ＡＮＫ,发现它     

酵母PHO80基因的克隆,表达及功能分析

利用原位杂交方法从野生型酵母菌染色体ＤＮＡ中克隆了ＰＨＯ８０基因,全长约４．２ｋｂ,包括１．１ｋｂ的上游序列和８７９ｂｐ的编码序列。以ＵＲＡ３基因为筛选标记,通过体内同源重组和营养互补筛选获得了ＰＨＯ８０基因缺失突变株。进一步研究了ＰＨＯ８０在细胞内的功能,它是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶结构基因以及调控基因ＰＨＯ８１表达的负调控因子,但不影响ＰＨＯ４和ＰＨＯ８５的表达。还构建了ＰＨＯ８０－ＬａｃＺ融合基因,探索它在细胞内的表达规律。β－半乳糖苷酶活力测定结果表明,ＰＨＯ８０基因在细胞内呈低水平表达,并受自身产物和ＰＨＯ８５的抑制,推测它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ８１基因的调控模式可能相似。     

酵母PH081基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷敏的     

醇母PHO81基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游序列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得到完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１基因的表达水平,研究了它的表达作用。ＰＨＯ８１基因为阻遏型表达,受无机磷浓度的控制,高磷使基因表达阻遏,低磷去阻遏。ＰＨＯ８１对其自身的表达有正调控作用,它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１基因的调控模式相似,但ＰＨＯ８１上游调控序列和ＰＨＯ５及ＰＨＯ１１的同源性很低。     

酵母K.fragilis甘油醛—3—磷酸脱氢酶基因的克隆

根据已克隆的马克斯克鲁维酵母（Ｋ．ｍａｒｘｉａｕｓ）,乳酸克鲁维酵母（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）与酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅｉａｅ）甘油醛－３－磷酸脱氢酶（ＧＡＰ）基因的核苷酸序列同源性分析设计ＧＡＰ探针,以该探针与脆壁克鲁维酵母（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＣＢＳ３９７基因文库进行原位杂交,得到一阳性克隆ｐＧ１并通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交实验得以证实。该克隆所携带的ＧＡＰ１基因的部分序列也已被测定。利用     

柱孢菌细胞色素P－450nor2cDNA克隆与表达

在真菌的反硝化作用中,一种独特的细胞色素Ｐ－４５０起着一氧化氮还原酶（Ｐ－４５０ｎｏｒ）的作用。用ｇｔｌｌ构建了柱孢菌（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎｔｏｎｌｅｉｎｅｎｓｅ）ｃＤＮＡ文库。纯化的柱孢菌Ｃ。Ｐ－４５０ｎｏｒ２免疫兔,制备抗体。并用抗体筛选出阳性克隆。回收插入片段（Ｐ－４５０ｎｏｒ２ｃＤＮＡ）克隆到表达载体ｐＹＥＳ２中,并在酵母系统中表达。经Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ分析验证,表达产物能与抗体反应产生特异性杂交带。酶分析结果表明：表达产物具有一氧化氮还原酶细胞包素Ｐ－４５０ｎｏｒ２的活性,能以ＮＡＤＨ或ＮＡＤＰＨ为供体,使ＮＯ还原先成Ｎ２Ｏ。     

酵母酸性磷酸酯酶基因表达与细胞周期活动

酵母酸性磷酸酯酶基因表达与细胞周期活动敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所上海２０００３１）酵母酸性磷酸酯酶基因家族是一个复杂的系统,其中包括４个结构基因：ＰＨＯ３、ＰＨＯＳ、ＰＨＯ１０和ＰＨＯｌｌ,分别编码不同的酸性磷酸酯酸。ＰＨＯ５、ＰＨＯ１０和...     

酵母PH081在酸性磷酸酯酶基因表达调控中的作用

利用酵母ＰＨＯ８１与大肠杆菌产β－半乳糖苷酶的融合基因,系统地研究了ＰＨＯ８１基因在酵母酸性磷酸醋酶的不同调控因子的单缺失株和双缺失株中的表达规律,它与酸性磷酸酯酶基因ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１的控制机制相似。构建了ＡＤＨ１启动子控制下ＰＨＯ８１表达质粒。在ＰＨＯ８１在细胞内组成型表达时,酸性磷酸酯酶基因的表达仍受无机磷的控制,揭示ＰＨＯ８１蛋白可能在不同浓度无机磷条件发生变构。ＰＨＯ８１在酸性磷酸酯酶基因表达系统中是一个中介因子。在此基础提出了一个酸性磷酸酯酶基因调控的分子模型。     

人GRY-RBP基因的表达及其RNA结合活性的初步鉴定

ＲＲＭ ＲＮＡ 结合蛋白在基因的转录后调控中起着重要作用．人ＧＲＹ－ＲＢＰ 是我们实验室最近克隆的一个新的全长ｃＤＮＡ,编码一个ＲＲＭ ＲＮＡ 结合蛋白．ＧＲＹ－ＲＢＰ 的全编码区用ＰＣＲ扩增后,克隆到ｐＥＴ３０ａ＋ 表达载体中,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得了高效表达,表达的ＧＲＹ－ＲＢＰ重组蛋白占细菌总蛋白的２１％ ．利用融合在ＧＲＹ－ＲＢＰＮ 端的Ｈｉｓ．Ｔａｇ,采取亲和层析的方法纯化了表达的重组蛋白．为了检测ＧＲＹ－ＲＢＰ的ＲＮＡ 结合活性及其所结合的ＲＮＡ 性质,将表达的蛋白与ｐｏｌｙ（Ａ）－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ结合,发现ＧＲＹ－ＲＢＰ能与ｐｏｌｙＡ （Ａ）结合,结合活性能被可溶性的ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）减弱．改变ＮａＣｌ浓度和加入不同浓度的酵母ｔＲＮＡ竞争物后,ｐｏｌｙ（Ａ）结合活性不变．     

酵母转录因子PHO2在PHO5,HIS4及HO基因表达中的作用

酵母ＰＨＯ２蛋白在多个不同基因的表达中起作用,是一个多效的转录激活因子。本文比较了该因子要ＰＨＯ５,ＨＩＳ４及ＨＯ３种基因表达系统中的作用。ＰＨＯ２的缺失使ＰＨＯ５在低磷时不能去阻遏;使ＨＩＳ４和ＨＯ的表达分别降低到正常的２５％和４０％。如果把克隆于抵拷贝穿梭质粒的ＰＨＯ２基因转入ＰＨＯ２缺陷的酵母菌,则３种基因的表达都恢复正常。     

缺铁胁迫的铁转运激活蛋白—AFT1

酵母（Ｘｃｃｈａｒｏａｐｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ功ｅ）是一种优良的研究许多真核细胞的基础代谢过程的模式生物。１９９５年,美国科学家（Ｙａｍａｐｏｃｈｉ－ｌｗａｉｅｔａｌ）利用筛选铁代谢异常的酵母突变体方法,克隆并鉴定了铁转运激活蛋白（ＡｎｆｆｅｈＶａｔＯＦＯｆｆＣＩＴＯＵＳｔａｐｏｆｔ,ＡＦＴＩ）ｌ‘］。将酵母ｆｒｅｌ的５’上游区融合到ｈｉｓ３基因上,由于铁对ｆｒｅｌ启动子的影响,这种结构在铁充足的条件下,不能表达,转化到不含有ｈｉｓ３的酵母细胞中后,细胞在高铁缺组氨酸的培养基上死亡,将少数存活的突…     

酶母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆

利用以３′－氨基糖苷磷酸转移酶基因（ＡＰＨＩ）为报道基因的一套启动子探针质粒ｐＳＫ－ｋａｎ４０１、ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５、ｐＳＫ－ｋａｎ１２３８,从酵母Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ基因组中克隆到８个有较强启动功能的ＤＮＡ片段,分析出３′端ＤＮＡ序列,并在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏ８ｍｙｃｅｓｅ ｌａｃｔｉｓ中通过检测报告基因与３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ表达量的比     

酵母PHO2蛋白及其变异体与PHO5USA体外的相互作用

酵母ＰＨＯ２蛋白及其变异体与ＰＨＯ５ＵＳＡ体外的相互作用杨军,敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,２０００３１）关键词酵母;ＰＨＯ２;突变;ＤＮＡ结合ＰＨＯ２是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶基因转录的正调控因子［１］,由５５９个氨基...     

豌豆钙调蛋白基因的克隆及七种来源钙调蛋白基因的分析

从豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）中提取总ＲＮＡ, 逆转录出ｃＤＮＡ 第一条链后, 以大麦钙调蛋白结构基因两端的寡聚核苷酸为引物, 用ＰＣＲ方法合成豌豆钙调蛋白基因, 克隆到Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ 载体上并测定其全序列。结果与已知的苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）、水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａＬ．）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）、电鳗（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、根瘤（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） 钙调蛋白基因相比,同源性较高（９１．３％ —６０．８％ ）,其不同部分则常常是Ｃ和Ｔ相替换。进一步分析发现,上述七种来源的钙调蛋白基因之间,常有某些核苷酸替换方式占优势,它们对于氨基酸密码子的使用也各有偏爱     

酵母PHO2与PHO4蛋白的激活活性的分析及两者的相互作用

ＰＨＯ２与ＰＨＯ４是酵母ＰＨＯ５基因的两个正调控因子,本文发现,ＰＨＯ２与酵母转录因子ＧＡＬ４的ＤＮＡ结合功能域融合后就能激活报道基因ｌａｃＺ的表达,其激活力受高低磷影响,表明ＰＨＯ２蛋白上存在酸性转录激活区。ＰＨＯ２蛋白上酸性氨基酸丰富的２８７－３２６肽段并非ＰＨＯ２的激活区。在ＰＨＯ２蛋白上２３０位Ｓｅｒ处于磷酸化状态２ＰＨＯ２才有激活作用,表明了这一磷酸化位点可能与ＰＨＯ２的转录激活能力有关     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因的克隆

当酵母细胞处于高渗压环境时,甘油被诱导合成以提高其胞内渗透压,这一过程受ＨＯＧ途径的调控。ＧＰＤ１基因为ＨＯＧ途径的重要靶基因,高效表达使胞内３磷酸甘油脱氢酶酶活水平提高可极大地提高甘油的产量。本研究将产甘油假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅｒｏｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３ＡＩ部分酶解后的５～１０ｋｂＤＮＡ片段与经ＢａｍＨＩ线性化及ＣＩＰ处理过的酵母大肠杆菌穿梭质粒ＹＥｐ５１连接,以大肠杆菌ＤＨ５α为受体,构建产甘油假丝酵母的染色体基因文库。通过遗传互补法,在含５０ｇ／Ｌ氯化钠的培养基上筛选出１５个转化子,对转化子０６０１进行了进一步鉴定,转化子０６０１所含质粒ＹＥｐ０６０１带有ＹＥｐ５１的标记并可以消除Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ６４２菌株由于其ＧＰＤ１,ＧＰＤ２两基因的缺失突变而表现出的渗透压敏感性,表明已克隆到产甘油假丝酵母的编码胞浆３磷酸甘油脱氢酶的基因     

人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析

外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）染色体上,获得遗传性稳定分泌表达株．利用酵母信号肽ＭＦα,对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计,使天然人ＴＰＯ成熟肽在毕赤酵母系统中分泌表达成功．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行分析,分子量约为６６ｋＤ处蛋白条带可被ＴＰＯ抗体识别;表达量约为０．１ｇ／Ｌ;Ｎ端氨基酸序列分析结果与设计的一致;表达产物对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（ｍｅｇａｋａｒｙ－ｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ,ＣＦＵ－Ｍｅｇ）具有明显的刺激作用．     

双价外壳蛋白基因植物表达载体的构建及马铃薯转基因植株的鉴定

在克隆了马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）、马铃薯Ｙ 病毒（ＰＶＹ）和马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）的外壳蛋白基因的基础上,构建同时包含ＰＶＸ和ＰＶＹ 与ＰＶＹ 和ＰＬＲＶ 两个外壳蛋白基因植物表达框架的表达载体,通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导转化烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ ）和生产上常用的几个马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ）优良品种：“Ｆａｖｏｒｉｔａ”、“虎头”、“克４”。经ＰＣＲ检测证明外源基因已整合到植物的染色体上,得到批量转基因植株。在转ＰＶＸ＋ＰＶＹ 外壳蛋白基因的烟草上接种ＰＶＸ （５ μｇ／ｍ Ｌ）、ＰＶＹ（２０ μｇ／ｍ Ｌ）病毒,得到有一定抗性的植株