津田芜菁和赤丸芜菁查尔酮异构酶基因的克隆及表达特性

目的：克隆津田芜菁和赤丸芜菁查尔酮异构酶（CHI）基因并研究其表达特性。方法：利用UV-A处理2种芜菁未见光块根24h,提取总RNA后通过RT-PCR方法克隆津田芜菁和赤丸芜菁的BrCH11和BrCH12基因,通过Northern杂交检测BrCH11和BrCH12基因的UV-A诱导表达特性。结果：BrCH11和BrCH12的开放读码框为756bp,编码251个氨基酸残基;氨基酸序列分析显示,BrCH11和BrCH12与萝卜CHI的同源性达91％,第11-222的肽段具有CHI结构域;BrCH11和BrCH12,2的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别在3个位点存在差异;BrCH11和BrCH12基因具有高度同源性;BrCH11和BrCH12基因的表达量与UV-A处理时间相关。结论：克隆了津田芜菁和赤丸芜菁的BrCH11和BrCH12基因,这2个基因的表达受UV-A诱导。     

津田芜菁和赤丸芜菁花青素合成相关基因的筛选

目的：确定赤丸芜菁块根花青素积累与光照时间的相关关系,筛选并鉴定依光型和非依光型花青素合成相关基因。方法：以不同时间的恒定光照处理赤丸芜菁块根,利用紫外-可见分光光度计测定块根花青素含量;利用芯片杂交和Northern杂交筛选并鉴定津田芜菁和赤丸芜菁花青素合成相关基因。结果：赤丸芜菁块根皮花青素的积累与光照时间无明显相关性;芯片杂交试验中,共有25个基因的表达发生明显变化,其中赤丸芜菁中表达上调的基因有6个,津田芜菁中表达上调的基因有19个;Northern杂交验证显示,津田芜菁中恒定光可以诱导细胞色素P450单加氧酶和一种假定的转运蛋白的编码基因表达,这些基因的表达量与处理时间存在相关关系。结论：筛选了部分花青素合成相关基因,为阐述依光型和非依光型花青素生物合成机制奠定了基础。     

芜菁UF3GT基因的克隆及表达特性

目的:克隆‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁的UDP-葡萄糖∶类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(UF3GT)基因并研究其表达特性。方法:利用RT-PCR方法克隆‘津田’芜菁BrUF3GT1基因和‘赤丸’芜菁BrUF3GT2基因,并进行生物信息学分析;通过Northern杂交检测BrUF3GT1和BrUF3GT2基因的UV-A诱导表达特性;对BrUF3GT1和BrUF3GT2基因进行原核诱导表达。结果:BrUF3GT1和BrUF3GT2的开放读框为1407 bp,编码468个氨基酸残基;氨基酸序列分析显示,BrUF3GT1和BrUF3GT2与拟南芥UF3GT的同源性为87%,从第16~453位氨基酸残基的肽段具有糖基转移酶家族成员的结构域;BrUF3GT1和BrUF3GT2基因具有高度同源性,核苷酸序列在7个位点存在差异,推导的氨基酸序列在1个位点存在差异;Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrUF3GT1和BrUF3GT2基因表达,基因的表达量与处理时间相关;原核诱导表达及纯化后可以获得相对分子质量分别约为51.88×103和51.89×103的BrUF3GT1和BrUF3GT2蛋白。结论:克隆了‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁的UF3GT基因,为初步阐明2种芜菁的花青素生物合成机理奠定了实验基础。     

芜菁消减文库特异基因片段功能的初步分析

目的：对4个消减cDNA文库中筛选到的特异基因片段进行功能分析,为筛选津田芜菁和赤丸芜菁花青素合成的特异基因和代谢途径奠定基础。方法：以不同处理的津田芜菁和赤丸芜菁块根为材料,采用抑制削减杂交构建4个消减cDNA文库并富集特异基因群体,同时对消减文库的特异基因片段进行初步的生物信息学分析。结果：通过功能聚类、代谢途径分析和基因注释等手段分析了消减cDNA文库的特异基因片段。结论：对消减文库特异基因片段的功能分析,为进一步分离和鉴定依光型和非依光型花青素合成相关基因奠定了基础。     

津田芜菁和赤丸芜菁苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的克隆和表达

以UV—A处理津田芜菁和赤丸芜菁块根24h后提取总RNA,再用RT—PCR方法分别克隆BrPAL1和BrPAL2基因的结果表明,BrPAL1和BrPAL2的开放读码框为2169bp,编码722个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrPAL1和BrPAL2与甘蓝型油菜苯丙氨酸解氨酶（PAL）的同源性达99％,第61～559的肽段具有PAL结构域。BrPAL1和BrPAL2的核苷酸序列在9个位置上存在差异,而推导的氨基酸序列仅在3个位置上有差异。BrPAL1和BrPAL2基因有高度同源性。Northern杂交结果显示,UV—A可以诱导BrPAL1和BrPAL2表达,基因的表达量与处理时间呈相关。     

芜菁的类黄酮3''羟化酶基因克隆和UV-A诱导表达特性

用UV-A处理'津田'芜菁和'赤丸'芜菁块根24 h后提取总RNA,以RT-PCR方法分别克隆到BrF3'H1和BrF3'H2基因.BrF3'HI和BrF3'H2的开放读码框为1 536 bp,均编码511个氨基酸.氨基酸序列分析显示,BrF3'Hl和BrF3H2与甘蓝型油菜F3tH的同源性达99%.在第45～476的肽段含有细胞色素P450家族基因的结构域.BrF3HI和BrF3'H2基因有高度同源性,核苷酸序列的17个位点处有差异,推导的氨基酸序列在5个位点处有差异.Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrF3HI表达,基因的表达量与UV-A处理时间呈相关,UV-A不能诱导BrF3'H2基因表达.     

‘津田’芜菁Transparent Testa Glabra 1（BrTTG1）基因的克隆及表达分析

TTG1（Transparent Testa Glabra 1）蛋白是一种WD40类蛋白,参与植物的生长和发育。采用RT-PCR方法从芜菁品种‘津田＇中克隆了BrTTG1 cDNA序列（GenBank登录号HM208590）。该基因cDNA开放阅读框长度为1 014 bp,编码一个由337个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白分子量为37.28 kDa,理论等电点为4.66。与其他植物中的TTG1蛋白进行同源性比对结果显示,BrTTG1与甘蓝型油菜的TTG1同源性最高。BrTTG1蛋白在31～337位氨基酸处含有WD40超家族的保守结构域。荧光定量PCR检测BrTTG1在‘津田＇芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在有花青素合成的红色‘津田＇芜菁根皮中表达量最高。     

‘津田芜菁’花色素苷生物合成相关基因的表达

利用黑暗、日光、人工恒定光处理花色素苷合成依光型的‘津田芜菁’试材。通过紫外．可见分光光度计测定恒定光处理下‘津田芜菁’块根皮中花色素苷的含量,结果表明,花色素苷含量与光处理时间成正相关。用从消减文库中筛选的花色素苷生物合成基因片段制备探针,Northern杂交结果显示,在所处理的48h之内,光可以诱导‘津田芜菁’中PAL、DFR、CHS、F3H和ANS基因的表达,这些基因的表达量随着光处理时间的延长而增加,而MYB基因的表达量在黑暗与光下基本相同。     

芜菁类黄酮3′-羟化酶基因的功能鉴定及启动子初步分析

类黄酮3′-羟化酶（Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H）是细胞色素P450单加氧酶,在花青素合成途径中催化二氢山奈酚生成二氢槲皮素,进而形成矢车菊色素。利用津田芜菁BrF3′H1和赤丸芜菁BrF3′H2基因构建过量表达载体后遗传转化烟草,转基因植株的花色加深。通过染色体步移法克隆了BrF3′H1和BrF3′H2基因上游846和851 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,BrF3′H1P和BrF3′H2P均包含TATA box、CAAT box、光调控元件、MRE、ABRE、ATGCAAAT-motif、ERE、O2-site、RY-element、LTR等多个顺式作用元件;二者的核苷酸序列在7个位点存在差异。利用BrF3′H1P和BrF3′H2P序列替换pCAMBIA1301植物表达载体的35S启动子后遗传转化烟草。GUS组织化学染色结果表明,BrF3′H1P和BrF3′H2P序列均能驱动GUS基因表达。通过PCR方法获得了BrF3′H1P和BrF3′H2P的一系列缺失片段,融合GUS基因后转化烟草。染色结果显示,BrF3′H1P和BrF3′H2P系列缺失片段均具有起始GUS基因表达的活性。BrF3′H1和BrF3′H2基因的功能鉴定及启动子的初步分析将为揭示津田芜菁和赤丸芜菁F3′H基因的光诱导表达调控机理奠定研究基础。     

利用cDNA微阵列分离津田芜菁花青素生物合成相关基因

花色素苷是植物的重要次生代谢产物, 在植物体内行使多种生理功能。利用UV-A处理48 h后津田芜菁块根变红, 以黑暗处理条件下的白色块根为对照, 与削减文库特异基因片段制备的cDNA微阵列进行杂交。UV-A处理条件下津田芜菁中表达上调的基因为81个, 表达下调的基因为47个, 表达上调的基因中包括与花青素生物合成直接相关的基因片段cytochrome P450, PAL, F3H, ANS, CHS, DFR和GST等。Northern杂交结果显示, UV-A处理48 h的津田芜菁试材中, PAL、CHS、F3H、DFR和ANS基因的表达量明显高于黑暗条件下白色块根中这些基因的表达量, 进一步验证了芯片杂交结果的可靠性。     

地被菊‘神韵’和‘繁星粉’DFR基因的克隆及表达特性

目的:克隆地被菊‘神韵’和‘繁星粉’的二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因,并研究其表达特性。方法 :利用RT-PCR方法克隆‘神韵’DgDFR1和‘繁星粉’DgDFR2基因,并进行生物信息学分析;通过Northern印迹检测DgDFR1和DgDFR2基因的表达特性。结果:DgDFR1和DgDFR2的开放读框分别为1125和1074 bp,分别编码由374和357个氨基酸残基构成的多肽,与菊花(Chrysanthemum×morifolium)DFR的同源性分别为99%和95%,9～330位肽段具有FR_SDR_e结构域和DFR结构域。DgDFR1和DgDFR2基因具有高度同源性,核苷酸序列在18个位点存在差异;推导的氨基酸序列的同源性为96%。Northern印迹表明,DgDFR1和DgDFR2基因在花中特异性表达。结论:克隆了‘神韵’和‘繁星粉’的DFR基因,为通过转基因技术控制地被菊花色、培育地被菊花色新品种奠定了实验基础。     

芜菁原生质体的分离及绿色荧光蛋白的瞬时表达

目的：分离芜菁叶片原生质体,建立蛋白质在芜菁原生质体的瞬时表达系统。方法：以津田芜菁成叶为试材,酶解分离原生质体;通过PEG介导的转化,将编码绿色荧光蛋白（GFP）的瞬时表达载体转入原生质体中,用激光扫描共聚焦显微镜检测原生质体中GFP的表达情况。结果：分离出大量的津田芜菁原生质体,并获得了较高的转化效率,GFP在整个原生质体中都有表达。结论：建立了津田芜菁原生质体瞬时表达系统。     

红花花青素合成酶基因的克隆及表达分析

根据红花转录物测序结果中得到的中间序列,采用R11-PCR和RACE方法从红花花瓣中克隆到1个4嬲基因的全长cDNA,该基因全长序列1226bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1050bp,编码349个氨基酸。生物信息学软件分析显示,该基因编码的蛋白理论分子量约为82．27kDa,等电点为5．09,序列里含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly（A）。保守结构域预测表明,该基因编码的蛋白具有典型的ANS蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2．0-酮戊二酸结合位点。结合其他物种的臌因构建系统树表日月,红花ANS蛋基因与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与芍药的亲缘关系最近。应用实时荧光定量PCR分析表明,ANS基因在红花的初花期和盛花期的表达量最高。     

Ultraviolet A-specific induction of anthocyanin biosynthesis in the swollen hypocotyls of turnip (Brassica rapa)

Ultraviolet A (UV-A)-mediated regulation of anthocyanin biosynthesis was investigated in swollen hypocotyls of the red turnip 'Tsuda'. The shaded swollen hypocotyls which contained negligible anthocyanin were exposed to artificial light sources including low fluence UV-B, UV-A, blue, red, far-red, red plus UV-A, far-red plus UV-A, and blue plus red. Among these lights, only UV-A induced anthocyanin biosynthesis and co-irradiation of red or far-red with UV-A did not affect the extent of UV-A-induced anthocyanin accumulation. The expression of phenylalanine ammonia lyase (PAL; EC 4.3.1.5), chalcone synthase (CHS; EC 2.3.1.74), flavanone 3-hydroxylase (F3H; EC 1.14.11.9), dihydroflavonol 4-reductase (DFR; EC 1.1.1.219), and anthocyanidin synthase (ANS; EC 1.14.11.19) genes was increased with time during a 24 h exposure to UV-A. In contrast, irradiation with red, blue, UV-B, and a combination of blue with red failed to induce CHS expression. Microarray analysis showed that only a few genes, including CHS and F3H, were induced significantly by UV-A, while a separate set of many genes was induced by low fluence UV-B. The UV-A-specific induction of anthocyanin biosynthesis and the unique gene expression profile upon UV-A irradiation as compared with blue and UV-B demonstrated that the observed induction of anthocyanin biosynthesis in red turnips was mediated by a distinct UV-A-specific photoreceptor, but not by phytochromes, UV-A/blue photoreceptors, or UV-B photoreceptors.