南极假丝酵母脂肪酶A的表面展示及酶学性质研究

采用a凝集素作为载体蛋白,首次将南极假丝酵母脂肪酶A展示在酿酒酵母细胞表面,通过MD平板筛选获得表面展示型的CALA酵母工程菌株。免疫荧光检测显示CALA被成功展示在酵母细胞壁表面,重组子经诱导后能在三丁酸甘油酯板上形成透明圈,说明展示的CALA具有活性。重组酵母在液体培养基培养72 h,活性达到最高,为80.4 U/g干细胞。酿酒酵母展示的CALA最适温度及pH值为70°C和pH 8.0。经50°C保温2 h,仍含有60%水解酶活力。展示的CALA在pH 7.0和pH 8.0溶液中比较稳定。经DMSO处理2 h,展示的CALA仍保持70%的活性。以上结果表明酵母展示的CALA可作为一种有潜质商业用途的全细胞催化剂。     

木聚糖酶和甘露聚糖酶在毕赤酵母中的共表达及产酶分析

木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种重要的半纤维素酶,也是两种重要的饲用酶制剂,通过毕赤酵母表达系统中的体外串联表达盒构建多拷贝的方法构建了木聚糖酶DSB和甘露聚糖酶Man A共表达重组质粒p PICZαA/DSB-ManA,将该重组质粒电转化至宿主菌毕赤酵母X33中获得共表达两种酶的重组菌X33/DSB-ManA,实现了两种酶的共分泌表达,经诱导表达后木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活分别为273. 6 U/ml和256. 8 U/ml,为单独表达重组菌X33/DSB和X33/Man A酶活的30. 4%和73. 4%。酶学性质的分析显示DSB和Man A的最适反应温度均为75℃,在45℃～75℃范围内具有较好的温度稳定性,酶活可保持最高酶活的60%以上; DSB最适pH为6. 5,Man A最适pH为6. 0,在pH 3. 0、40℃条件下,Man A处理1h能保持最高酶活的80%以上,DSB处理1 h时能保持最高酶活的50%以上; DSB和Man A对多种金属离子和化学试剂(浓度为1 mM)具有较好的耐受性,均可保留60%以上的酶活力。通过单一菌株成功完成了不同酶的共表达,为复合酶饲料添加剂的生产和应用研究提供了一定的理论依据。     

纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

首先将来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶基因CsCEm进行密码子优化,然后进行全基因合成,再将其引入到载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-CsCEm并转化入毕赤酵母GS115,得到酵母工程菌株.经微孔板筛选、摇瓶筛选得到酶活最高的重组工程茵GS115-4-19.该菌株经甲醇诱导144 h后,摇瓶发酵液上清酶活达到0.42 U/mL.酶学性质研究结果表明:该酶的最适pH为7.5,且在pH 6.0 ～8.0范围内相对酶活都在80％以上;在pH 4～9的缓冲液中放置24 h后仍保持原酶活力的80％以上;最适温度为80℃,在60℃～80℃保温30 min后,相对酶活在80％以上.动力学研究结果表明该酶对底物乳糖的Km和Vmax分别为(120.27±9.96) mmol/L和(1.035±0.05) mmol/L/min.纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的成功表达为生物酶法合成乳果糖提供了重要参考.     

植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母po1h中的表达

本实验通过PCR方法从毕赤酵母GS115-phyA中扩增出不含有信号肽及内含子的黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因,并将其克隆到表达载体pINA1297中,得到表达载体pINA1297-phyA,利用醋酸锂转化法将线性化载体转化到解脂耶氏酵母po1h中,通过YNBcasa和PPB平板筛选出阳性表达菌株,阳性菌株在YM培养基中28℃培养6d后酶活达到最大为636.23U/mL。表达上清经SDS-PAGE分析得到表达植酸酶分子量约为130kDa,但通过去糖基化处理后其分子量变为51kDa,与理论值相符。经过酶学性质分析表明重组植酸酶最适pH为5.5,最适温度为55℃,该酶在pH2.0~8.0处理1h后仍有较高酶活,并且90℃处理10min后还有86.08%的残留酶活,其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也较强。     

基于密码子优化的FAD依赖葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

旨在获得表达量高的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶。通过FAD依赖的葡萄糖脱氢酶密码子优化,人工合成基因片段,构建重组表达载体pMD-GDH,转化毕赤酵母X33菌株后利用甲醇诱导培养实现分泌表达。结果显示,经试管水平筛选阳性转化子获得一株酶活高且稳定的重组菌株,在10 L发酵罐培养时经过136 h诱导培养,酶活达到257 600 U/L。酶学性质分析表明,以葡萄糖为底物时最适温度和pH分别为55℃和7.0,在50℃下处理150 min仍有70%的活性,在pH 4-7范围内,37℃保温4 h,FAD-GDH仍能保持50%以上的活性。金属离子Cu~(2+)对酶活抑制作用比较大。FAD-GDH的底物专一性较好,以葡萄糖为最适底物。经毕赤酵母密码子偏好性优化实现了FAD依赖的葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达,为应用于血糖检测提供理论依据。     

黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析

根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计合成一段来自黑曲霉BK01的嗜热β-甘露聚糖酶基因,通过构建表达载体pPICZαA-man线性化后电转化入不同的毕赤酵母宿主,获得最佳重组菌KM71-MAN,其发酵罐发酵酶活最高达2 318.85 IU/mL。表达产物纯化后的分子量约为40 kD,最适反应温度为80℃,最适pH为5.0。该酶在70℃(pH5.0)保温44 h仍能保留43%的酶活力且在pH3.0-7.0范围内保温70 h(50℃)酶活力仍能保留85%以上。利用发酵罐所产重组酶酶解魔芋胶制备甘露低聚糖,产物以甘露二糖和甘露六糖为主,甘露低聚糖得率为55.6%。该重组β-甘露聚糖酶具有良好的热稳定性和pH稳定性,在魔芋制备甘露低聚糖中具有较好的应用潜能。     

β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达

应用表面表达技术对来自Trichodermareesei的β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达及后期性质进行了研究。实验结果表明酵母表面表达酶有活性,该酶的最佳诱导时间为24h,最适温度是70℃,而酶活的最适pH是5．5。使异源表面表达了Bgl1的酵母在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长,发酵结果表明纤维二糖被明显利用了,但在培养186h后,发酵液中仍残留一定量的纤维二糖。这种技术对纤维素发酵系统中纤维二糖酶活性低的现状有所帮助。     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。     

嗜热脂肪芽孢杆菌羧酸酯酶的异源表达及酶学性质研究

运用生物信息学技术从嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus) CICC 20156中克隆获得羧酸酯酶基因,构建黑曲霉和毕氏酵母表达质粒,将重组质粒分别转化毕氏酵母GS115和黑曲霉pyrG基因缺陷株M54．SDS-PAGE和Western blot检测显示：携带His标记的外源蛋白在转化真菌宿主中均获得了高效分泌性表达,毕氏酵母和黑曲霉表达的外源蛋白分子质量均约为29 ku,蛋白质浓度分别为30.7 mg/L和15.3 mg/L．生物学活性测定表明,毕氏酵母与黑曲霉表达的羧酸酯酶单位蛋白酶活分别为22 671 U/mg和21 438 U/mg．酶学性质研究显示,两种表达系统表达的重组羧酸酯酶的酶学特性基本一致,它们在40～70℃范围内均显示较好的酶活性,最适反应温度为60℃．70℃处理30 min,毕氏酵母和黑曲霉表达重组羧酸酯酶残余酶活分别为 76.7%和67.6%,显示出良好的热稳定性．在pH 6.5～8.5的范围内显示较高酶活性,最适pH为8.0．上述研究首次实现了具有良好热稳定性的嗜热脂肪芽孢杆菌羧酸酯酶在黑曲霉和毕氏酵母中高效异源分泌性表达,其中毕氏酵母羧酸酯酶的产量要高于黑曲霉的酶产量,但考虑到重组黑曲霉表达外源性蛋白无需使用任何诱导剂,黑曲霉菌表达热稳定性羧酸酯酶可能具有更好的应用前景．     

扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达与重组酶性质

通过PCR方法从扣囊复膜孢酵母基因组DNA中克隆获得α-淀粉酶基因成熟肽编码区（SfA）,插入乳酸克鲁维酵母表达载体pKLACl的d因子信号肽下游,构建重组表达载体pKLACl-SfA。重组载体转化乳酸克鲁维酵母GG799,筛选获得表达α-淀粉酶SfA水平较高的重组茵。酶活检测和SDS．PAGE电泳检测均显示,重组茵分泌重组酶SfA到发酵液中。酶学性质研究表明：SfA最适温度为45℃,最适pH5．0,在pH4．5～5．5、50℃条件下保持稳定。Ca2＋等二价金属离子对SfA酶活有激活作用,EDTA强烈的抑制SfA活性。HPLC分析显示SfA水解糊精获得麦芽寡糖和少量葡萄糖,其中麦芽三糖是主要产物,占水解产物总量的52％。