螺旋藻的纯化*

观察了螺旋藻生长过程中藻丝和杂菌的生长规律,发现中性细菌和碱性细菌的数量始终是藻丝的10⁵～10⁶倍。采用常规的稀释平板法、毛细管法和挑单藻法均无法可靠地获得无菌纯藻。设计用低速离心法洗涤下沉性藻丝,用过滤法洗涤上浮性藻丝,对藻丝进行预处理洗去大量杂菌;对迁移性和非迁移性藻株分别采用夹层法和平板法纯化藻株,使得单根藻丝在平板上形成藻落,获得无菌纯藻。     

绿色荧光蛋白gfp基因在钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株中的表达

将钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株在24℃培养,经2 mmol/L的EDTA预处理24 h;采用功率300 W的超声波处理70 s获得单细胞样品,以本实验室构建的携带gfp基因的质粒p215t转化A9藻株单细胞藻液,利用Amp作为选择标记,使单细胞在平板上再生长出单藻落,获得17株具有Amp抗性的转化藻株,转化率3.73‰。在390 nm紫光激发下,生长30天的转化藻丝体发出稳定绿色荧光;培养45天后具有绿色荧光的藻丝出现断裂、具有荧光藻丝长度缩短的现象。实验结果初步表明:报告基因gfp在螺旋藻中得到稳定有效的表达,可以采用单细胞再生形成单藻落技术进行螺旋藻的基因克隆。     

滇池中溶藻细菌的分离鉴定及其溶藻效应

【背景】藻类水华或赤潮在世界范围内频发,带来各种危害,亟需找到有效途径控制水华或赤潮。溶藻细菌具有杀死藻类控制藻类生物量的能力,可以作为防治水华和赤潮的有效工具。【目的】分离并鉴定滇池中的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)及其溶藻细菌,对溶藻菌作用于铜绿微囊藻的溶藻效应进行研究,初步了解其溶藻特性与溶藻机制。【方法】采用LB平板稀释涂布,再经多次划线分离纯化细菌,测定16SrRNA基因序列以鉴定细菌种类;采用毛细管分离的方法分离铜绿微囊藻,并测定其cpcBA基因序列以鉴定蓝藻种类;采用热乙醇法提取叶绿素a,从而计算溶藻效率;基于过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)探究藻细胞在溶藻菌处理下的抗氧化系统响应。【结果】共分离获得11株微囊藻和17株针对铜绿微囊藻的高效溶藻菌。选取其中一株生长速度最快的铜绿微囊藻DCM4和一株溶藻效果最好的溶藻菌Sp37 (Bacillus siamensis)进行后续研究。Sp37对DCM4的4 d溶藻率达到92.4%±1.5%,且对微囊藻属的水华微囊藻(M. flos-aquae)和惠氏微囊藻(M.wesenbergii)均有溶藻效果,而对绿藻没有溶藻效果。Sp37的原菌液和无菌滤液对DCM4的4d溶藻率分别为86.8%±4.3%和81.1%±2.2%,两者没有显著差异(P0.05)。Sp37菌体对DCM4的溶藻率为25.4%±7.3%。Sp37无菌滤液经不同温度和pH处理之后的溶藻率与未经处理的无菌滤液的溶藻率无明显差异。Sp37无菌滤液处理藻细胞会使藻细胞的CAT、GSH和MDA含量发生变化。【结论】菌株Sp37对铜绿微囊藻DCM4具有高效的溶藻作用,而且对微囊藻属具有一定的溶藻特异性。Sp37是通过分泌胞外物质间接溶藻,且溶藻物质具有热稳定性和酸碱稳定性。Sp37无菌滤液处理藻细胞会触发藻细胞抗氧化系统,并且会损伤藻细胞膜。Sp37无菌滤液很可能是通过对藻细胞造成氧化胁迫,最终导致藻细胞死亡的。     

湛江等鞭金藻对抗生素的反应及无菌化培养

研究了5种抗生素在不同浓度下对湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)生长的影响,采用混合添加抗生素法获得无菌藻株.结果表明,(1)不同抗生素对湛江等鞭金藻生长的影响存在差异,湛江等鞭金藻对氯霉素最敏感,浓度为50 μg·mL-1时抑制率为27.02%,浓度＞50 μg·mL-1时抑制率达80%,湛江等鞭金藻对青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素不敏感,后3种抗生素在低浓度时对藻细胞生长有促进作用;(2)除50 μg·mL-1青霉素处理外,青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素其它浓度处理均有明显的抑菌作用;(3)采用500 μg·mL-1链霉素,1000 μg·mL-1卡那霉素和50 μg·mL-1庆大霉素的4个组合混合添加抗生素,均获得了无菌藻株,且对生长有促进作用.     

溶藻细菌筛选及溶藻活性物质对铜绿微囊藻生理活性的影响

从太湖水华水体中分离纯化细菌, 再将细菌的LB液体和固体斜面纯培养物分别收集后感染铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)细胞, 从中筛选出7株具有溶藻活性的细菌, 并对其中一株溶藻细菌THW7的溶藻方式及溶藻活性物质对铜绿微囊藻生理活性的影响进行了初步研究。结果表明: 仅采用细菌的LB液体纯培养物进行溶藻细菌筛选会存在误筛或高估溶藻效率的风险, 而采用细菌的固体斜面纯培养物进行筛选则可避免以上风险; 溶藻细菌THW7通过分泌胞外活性物质的方式间接溶藻; 在THW7无菌滤液胁迫下, 铜绿微囊藻的生长受到显著抑制(P<0.01), 10d溶藻效率可达94.38%, 光合系统活性也显著降低(P<0.01), MDA含量积累, SOD、POD、CAT活性整体呈现先升高后降低的趋势且显著高于对照组(P<0.01)。推测菌株THW7分泌的溶藻活性物质可能作用于铜绿微囊藻细胞的光合系统Ⅱ, 阻碍电子传递, 抑制其光合作用过程, 并对藻细胞产生氧化损伤, 破坏藻细胞细胞膜的完整性, 从而实现溶藻作用。     

白假丝酵母菌突变株ORF19.2500的功能研究

目的筛选50株白假丝酵母菌基因缺失菌,寻找出对白假丝酵母菌生物被膜形成相关基因,进一步探究白假丝酵母菌生物膜的致病机制。方法利用培养生物被膜的方法筛选50株基因缺失菌;利用XTT法验证所筛选出的白假丝酵母菌突变株ORF19.2500生物被膜形成缺陷;进一步观察ORF19.2500基因缺失菌生长、菌丝形成。结果用XTT法证明白假丝酵母菌突变株orf19.2500生物膜形成缺陷,且生长曲线和滴琼脂平板的方法均提示其生长速率减慢。在spider培养基上白假丝酵母菌突变株orf19.2500不能诱导菌丝形成,但在YPD+10%小牛血清则菌丝形成正常。结论白假丝酵母菌突变株orf19.2500可利用spider培养基缺陷而影响其酵母、菌丝二态性的转化,及其生物被膜的形成。     

微藻无菌化技术的研究进展

无菌纯藻是深入开展藻类生理学和遗传学研究的基础。目前已有涂布划线法,离心洗涤技术、稀释滤过技术、辐照技术、毛细吸管技术、抗生素技术、化学消毒技术、利用其他生理特性等技术用于微藻的纯化。拟介绍国内外近年来微藻无菌纯化技术的研究进展。     

螺旋藻的超低温保存法

【目的】建立螺旋藻藻种的超低温保存法,并探究该方法对不同种类螺旋藻藻种保存的适用性。【方法】采用碘量法筛选出耐低温螺旋藻藻株,通过单因素和正交试验设计对耐低温螺旋藻超低温保存法进行条件优化,并以优化后的超低温保存法对8株不同种类的螺旋藻进行保藏实验。【结果】FACHB-351为筛选出的耐低温螺旋藻藻株;优化后的超低温保存方案为:以10%蔗糖溶液做冷冻保护剂,将藻丝体密度为1.0×107 CFU/m L的藻悬液于4°C驯化72 h,再将藻液和保护剂分别在0°C预冷30 min后混匀,混匀后于0°C停留3 h,然后投入液氮保存。保藏实验结果表明,保藏6个月时除了耐低温性较差的FACHB-350、FACHB-1070、FACHB-902螺旋藻存活率为0,不能恢复生长繁殖,其它5种耐低温性较好的螺旋藻均能在一定时间内恢复正常的生长繁殖,其中FACHB-351的存活率最高,为39.33%。【结论】建立的超低温冷冻保存法可用于耐低温性较好的螺旋藻藻种的长期保存。     

鄱阳湖的中国水华蓝藻新记录属气丝藻属

2012年4月和10月在江西省鄱阳湖进行野外调查时, 发现一种浮游的丝状蓝藻。通过分离纯培养, 获得了6个纯化藻株。根据藻株主要形态学特征及其16S rRNA基因序列与比较, 鄱阳湖这些藻株与老挝的2株Aerosakkonema funiforme较为相近, 其中16S rRNA基因序列的相似度达到98%。鉴于这些藻株不同于颤藻目中其他属的藻株, 因此确定为我国一水华蓝藻新记录属气丝藻属Aerosakkonema Nanda Watanabe 2012, 模式种为索状气丝藻Aerosakkonema funiforme Nanda Watanabe 2012。       

溶藻细菌FS1的溶藻效果与机制初探

近年来,由水体富营养化引发的蓝藻水华频繁暴发,对水体生态系统平衡产生了重大影响,给人类健康也带来严重威胁。生物法除藻具有高效性、环境友好等优点,因此,如果能获得具有较高溶藻效率的溶藻细菌,选择生物法除藻更为理想。从菏泽一富营养化池塘分离得到1株溶藻细菌FS1,经16S rDNA测序分析鉴定为芽胞杆菌属。实验以铜绿微囊藻为研究对象,采用血球计数板法计算反应前后藻细胞的浓度,对不同生长阶段溶藻细菌FS1的溶藻效果进行了探究。停滞期、对数期、稳定期和衰亡期的除藻率分别为7.1%、24.3%、57.0%和45.5%,结果表明,处于稳定期的FS1对铜绿微囊藻的去除效果最佳。细菌溶藻方式的研究结果表明,溶藻细菌是通过分泌溶藻物质间接溶解藻细胞。