应用特异PCR快速鉴定微生物肥料中4种乳酸菌

【目的】植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和德氏乳杆菌(L.delbrueckii)是微生物肥料生产中常用的乳酸菌,它们表型特征相似,若采用传统方法鉴定则费时费力,为准确、快速地鉴定这些种,建立种特异PCR方法。【方法】利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具),以GenBank数据库中上述菌种的recA和gyrB为靶基因,设计和筛选种特异性引物从而建立相应特异PCR鉴定方法。【结果】经过乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)7个属24个种共40株标准菌株的实验验证,4个目标种分别扩增出唯一的目的产物,而其他种均无目的扩增产物。采用建立的4种特异PCR方法对产品中分离的16株乳杆菌进行鉴定,结果与16S rDNA序列分析、Biolog鉴定结果一致。【结论】建立的特异PCR鉴定方法均具有较高的种内通用性和种间特异性,可快速、准确的用于微生物制剂中植物乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌的检测和鉴定,具有较好的应用前景。     

黄翅大白蚁后肠几丁质降解微生物的分离与鉴定

【目的】从培菌白蚁——黄翅大白蚁后肠微生物菌群中分离能降解几丁质的细菌。【方法】以胶体几丁质为唯一碳源,根据胶体几丁质水解透明圈的大小进行筛选。通过形态学、生理生化以及16SrRNA基因序列分析进行菌株鉴定。【结果】从黄翅大白蚁肠道中筛选到8株能够降解胶体几丁质的细菌,它们分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、指孢囊菌属(Dactylosporangium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。8株菌均具有几丁质酶、β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶活性。【结论】从黄翅大白蚁后肠中获得8株能够降解胶体几丁质并具有其他碳水化合物降解酶活性的细菌,这一研究为了解白蚁肠道微生物协助白蚁消化食物机制提供了依据。     

醉马草内生菌的分离、鉴定及杀虫效果

【目的】探明醉马草内生菌的种类,筛选对农作物虫害有毒杀作用的菌株。【方法】采用研磨法从健康醉马草植物的根、茎、叶和种子中进行菌种分离;通过对其形态、培养特征、生理生化及其他生物学特性的研究;16SrDNA及ITS序列的系统发育学分析进行鉴定;用玻片浸渍法和喷雾法筛选产杀虫活性物质菌株。【结果】获得细菌89株,分别属于枯草芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonnas)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)8个属;真菌2株,分别属于麦角菌属(Claviceps)和毛壳菌属(Chaetomium)。经初筛及复筛,内生菌娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei(GA)和黑麦麦角菌Claviceps purpurea(PF-2)发酵液粗提物对棉蚜虫(Aphis gossypii)致死率达85%以上。【结论】醉马草内生菌株PF-2和GA的粗提代谢物对棉蚜虫有明显的毒杀作用,为开发新的生物源农药提供了生物源物质。     

基于可培养方法分析云南腾冲小空山火山谷芽胞杆菌分布特征

【目的】为了解云南腾冲小空山火山谷土壤中可培养芽胞杆菌种类分布特征。【方法】采用可培养手段对小空山火山谷阳坡、谷底和阴坡土壤中的芽胞杆菌进行分离培养,根据16S rRNA基因序列同源性对分离菌株进行鉴定,并分析系统发育地位。利用Canoco5软件分析采样点芽胞杆菌种类分布特征与土壤样品理化性质的相关性。【结果】从火山谷土壤样品中共分离获得180株芽胞杆菌,16S rRNA基因测序鉴定结果表明分离菌株隶属于芽胞杆菌纲2个科(芽胞杆菌科和类芽胞杆菌科)、6个属、34个种,其中芽胞杆菌属(Bacillus) 11个种,类芽胞杆菌属(Paenibacillus) 14个种,短芽胞杆菌属(Brevibacillus)3个种,赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)4个种,嗜冷芽胞杆菌属(Psychrobacillus)1个种和绿芽胞杆菌属(Viridibacillus)2个种,其中7个菌株与其最近模式菌株16SrRNA相似性低于种的界定阈值(98.65%),为芽胞杆菌潜在新物种。优势属为芽胞杆菌属和类芽胞杆菌属,优势种为蕈状芽胞杆菌(Bacillusmycoides),图瓦永芽胞杆菌(Bacillustoyonensis),蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus),解木糖赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillusxylanilyticus),蜂房类芽胞杆菌(Paenibacillusalvei)和沙地绿芽胞杆菌(Viridibacillus arenosi)。其中16个种分离自阳坡,29个种分离自阴坡,9个种分离自谷底,三者共同种类为6种。阳坡、谷底和阴坡的芽胞杆菌种群分布Bray-Curtis相似性为62.4%,多样性分析结果表明,Shannon指数(H′)大小次序为阴坡阳坡谷底。环境因子分析发现,芽胞杆菌种群分布多样性特征与其土壤的海拔高度、碳氮比和硫含量呈负相关,而和碳源和氮源含量呈正相关。【结论】从以上结果得出,云南腾冲火山谷有着较为丰富的芽胞杆菌资源,且还存在可分离培养的芽胞杆菌的潜在新物种,为利用火山微生物资源提供了保障。     

具有ACC脱氨酶活性的海滨锦葵(Kosteletzkya pentacarpos)内生细菌对小麦耐盐性的影响

从盐生植物海滨锦葵块根中分离内生细菌43株,经形态学特征和16S r DNA序列相结合的方法鉴定,分属10个种属,其中芽孢杆菌属是优势属,其次是假单胞菌属和农杆菌属,蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是优势种。对海滨锦葵内生细菌ACC脱氨酶活性的测定显示,其中5种菌明显具有ACC脱氨酶活性。用筛选到的5种细菌接种盐胁迫下小麦根系并测定其对于小麦耐盐性的影响。结果表明,蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌四种芽孢杆菌均能显著提高盐胁迫下小麦幼苗的干物质重和叶绿素含量,并能显著提高保护酶(SOD、POD、CAT)活性,对盐胁迫的毒害有一定的缓解作用。绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)对小麦幼苗株高、根长、鲜重、干重、叶绿素含量和保护酶活性的提高也具有一定的作用。上述分析表明从海滨锦葵块根中分离出的5株具有ACC脱氨酶活性的内生细菌均能提高小麦幼苗的耐盐性。     

柑橘黄龙病寄主长春花内生细菌的分离及功能鉴定

【目的】感柑橘黄龙病长春花植株与健康长春花植株不同部位内生细菌菌群结构及功能对柑橘黄龙病菌与长春花内生细菌的相关性研究提供理论基础。【方法】利用兼性厌氧可培养技术以及植物内生菌功能特性分析相结合的方法。【结果】分别从感病和健康长春花叶、茎、根的组织中分离获得67株内生细菌,与GenBank中29种细菌的相似性达到97%-100%。其中短小杆菌属(Curtobacterium sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)为感病长春花内生细菌的优势菌群,鞘胺醇单胞菌属(Brevundimonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)为健康长春花内生细菌的优势菌群;马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)为两者的共同优势菌群。29种内生细菌进行功能分析,其中6株内生细菌至少具有4种功能特性,分属于马胃葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小杆菌属、摩氏摩根菌(Morganella morganii)及溶杆菌属(Lysobacter sp.)5个属。【结论】感病与健康长春花植株中均含有丰富的内生细菌且差异较大,黄龙病菌的存在改变了长春花原有内生细菌的菌群结构。通过分析菌群的差异,有望找到与柑橘黄龙病菌生长相关的菌种。     

一件出土饱水木漆器文物中可培养细菌的鉴定及对木材的腐蚀作用

【背景】饱水木质文物易受到微生物侵害,目前国外围绕饱水木质文物微生物病害已开展多方面研究,并取得阶段性进展,而国内在饱水木质文物微生物学技术方面的报道比较少。【目的】研究保藏水环境中出土饱水木漆器F446及水中细菌的种类,以及对木材的腐蚀作用。【方法】采用16S rRNA基因序列分析方法及生理生化试验,对饱水木漆器F446及水环境中细菌进行鉴定,并选取典型菌按5×10~8个/瓶菌量接种马尾松心材(悬于无菌自来水中),37°C培养120 d,测试木材的损失率。【结果】从F446文物和水样中分离的53株细菌中,21株被鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus),为优势菌属,其中蜡样芽孢杆菌(B.cereus)19株,病研所芽孢杆菌(B.idriensis)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)各1株;11株菌被鉴定为短杆菌属(Brevibacterium),此外还有4株短波单孢菌属(Brevundimonas),5株粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis),5株Altererythrobacter,2株水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii);另外,还有解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum saccharolyticum)、梭型芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)、Leucobacter aridicollis、Ochrobactrum pseudogrignonense、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)菌株各1株。菌株A5、A6分别为类芽孢杆菌(Paenibacillus)和Altererythrobacter属中的疑似新种。从典型菌中选取15株菌回接木材进行腐蚀试验,结果显示,9株细菌与对照组比较存在极显著差异,说明这些菌对马尾松木材有一定的腐蚀作用,但是腐蚀率非常低,最高仅1.38%,表明这些细菌对试验木材马尾松腐蚀并不严重。【结论】F446木漆器文物样品中优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus),水样中优势菌属依次为短杆菌属(Brevibacterium)、短波单孢菌属(Brevundimonas)和Altererythrobacter。从F446木漆器文物和水样中分离出的细菌对木材的降解非常缓慢,短期内腐蚀作用有限。     

蜘蛛抱蛋属植物内生细菌的多样性及其抗菌活性筛选

【背景】药用植物中蕴含多样性丰富的内生菌资源,这些微生物产生的多种新型物质在制药领域表现出较好的应用前景。【目的】研究蜘蛛抱蛋属(Aspidistra Ker-Gawl.)植物内生细菌的多样性,探索药用植物内生细菌在药用活性产物方面的开发潜力,以期发现具有抗菌活性的次级代谢产物。【方法】对9种13株新鲜的蜘蛛抱蛋植物进行表面消毒,采用5种分离培养基分离内生细菌;根据菌落形态特征排除重复菌株,并测定其16S rRNA基因序列,构建系统进化树分析内生细菌多样性;将菌株分别用2种培养基发酵,使用耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis ATCC 700044)、水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae PXO99A)、白色念珠菌(Candidaalbicans ATCC 10231)、肺炎雷伯菌(Klebsiella pneumoniae ATCC 700603)和耐药粪肠球菌HH22(Enterococcus faecalis HH22)5种检定菌对分离菌株的发酵液进行抑菌活性筛选。【结果】从植物组织中分离得到了234株内生细菌,根据形态初步排重得到156株植物内生细菌;基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树显示它们分属于3门10目22科29属,其中链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和根瘤菌属(Rhizobium)的菌株广泛地分布在不同种的蜘蛛抱蛋植株中,且占据一定优势;发现可能的潜在新分类单元6个;156株内生细菌中38株菌的发酵液具有抑菌活性,初筛阳性率为23.7%。【结论】蜘蛛抱蛋植物组织中含有种类多样的内生细菌,它们可能是抗菌生物活性次级代谢产物的有效来源。     

角蛋白酶生产菌株的分离筛选与鉴定

【目的】分离筛选具有高效脱毛能力的野生角蛋白酶生产菌株,开发无硫制革生物脱毛剂。【方法】以贮备原料皮的特定环境中的污水样品为菌株源、在含诱导物脱脂羊毛粉的培养基中的富集、筛选与评估其发酵液脱毛能力的多相筛选方法分离选育高产角蛋白酶野生菌株。通过形态学、生理生化特征,Biolog全自动分析以及16SrDNA基因序列分析等方法多尺度地鉴定目的菌株。【结果】定向筛选得到了一株高活力,无硫脱毛效率高的菌株。鉴定结果表明,该菌株为地衣芽孢杆菌属,故命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)X-47。【结论】应用多相定位选育技术筛选出的菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)X-47,产角蛋白酶活力高,脱毛效率高,对胶原作用力弱的特点,具有开发无硫脱毛生物助剂的潜力。     

低温胁迫下链霉菌TOR3209对番茄根和茎可培养内生细菌的影响

【背景】低温是影响北方温室番茄稳产与高产的主要障碍因子,前期研究明确链霉菌(Streptomycessp.)TOR3209能显著提高番茄的耐低温能力。【目的】揭示菌株TOR3209提高番茄抗冷性与番茄内生细菌结构和特性的关系。【方法】在番茄根部施用TOR3209菌剂,分别在低温(5℃)和常温(25℃)条件下,采用平板分离法和16S rRNA基因序列扩增研究菌株TOR3209处理对番茄根系和茎部内生细菌菌群结构的影响。【结果】共分离、纯化获得内生细菌69株,分属4门20科28属。分析发现,与对照相比,在低温和常温下,接种菌株TOR3209均可提高番茄根茎内生细菌群落的丰富度和多样性。在门水平上,番茄根茎厚壁菌门的相对丰度显著提高,变形菌门和拟杆菌门的相对丰度显著降低;在属水平上,芽孢杆菌属的相对丰度显著提高,假单胞菌属和黄杆菌属的相对丰度则显著降低;在种水平上,菌株TOR3209处理能显著提高番茄根茎解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)和阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)等共有芽...     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.