植物反转录转座子及其在功能基因组学中的应用

高等植物中的反转录转座子是构成植物基因组的重要成分之一.它分病毒家族和非病毒家族两类,病毒家族包括反转录病毒和类似于反转录病毒的非病毒转座子,病毒家族中的反转录转座子可再细分为Ty3-gypsy类和Ty1-copia类;非病毒家族可细分为LINE类和SINE类.正常情况下大部分反转录转座子不具有活性,某些生物或非生物因素胁迫可激活部分反转录转座子转座.反转录转座子自身编码反转录酶进行转录,以"拷贝-粘贴"的转座模式导致基因组扩增和进化.具有活性的反转录转座子通过插入产生新的突变,可作为一种基因标签技术,应用于功能基因组学研究,并成为研究植物基因功能和表达的重要技术平台.本文综述了近几年来在植物反转录转座子方面的研究进展,主要包括植物反转录转座子的结构、特征、活性及其对基因组的影响和它们在功能基因组学中的应用.     

烟草环斑病毒IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

本研究首次应用免疫捕捉反转录实时荧光PCR技术(IC-RT-Realtime PCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了抗原抗体特异性结合、核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,从而使病毒检测在特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上比传统的DAS-ELISA方法都有显著提高,解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题.     

三重RT-PCR同步检测马铃薯多种病毒影响因素*

根据病毒外壳蛋白区序列设计PVX、PVS特异性引物对 ,根据P1基因区序列设计PVA特异性引物对 ,应用三重RT PCR同步检测马铃薯X病毒 ,马铃薯A病毒及马铃薯S病毒 ,分别得到 5 62bp、 2 5 5bp、 1 82bp大小的扩增片段。试验从反转录反应、PCR反应及循环条件 3方面讨论了试剂和循环条件对三重RT PCR同步检测 3种病毒的影响。结果表明反转录反应中dNTPs浓度、 3种病毒下游引物浓度比例对整个反应影响较大 ;其次是PCR反应中MgCl₂ 浓度和退火温度 ;     

烟草环斑病毒IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

本研究首次应用免疫捕捉反转录实时荧光PCR技术(IC-RT-RealtimePCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了抗原抗体特异性结合、核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,从而使病毒检测在特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上比传统的DAS-ELISA方法都有显著提高,解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题。     

三重RT-PCR同步检测马铃薯多种病毒影响因素

根据病毒外壳蛋白区序列设计PVX、PVS特异性引物对,根据P1基因区序列设计PVA特异性引物对,应用三重RT-PCR同步检测马铃薯X病毒,马铃薯A病毒及马铃薯S病毒,分别得到562bp、255bp、182bp大小的扩增片段。试验从反转录反应、PCR反应及循环条件3方面讨论了试剂和循环条件对三重RT-PCR同步检测3种病毒的影响。结果表明反转录反应中dNTPs浓度、3种病毒下游引物浓度比例对整个反应影响较大;其次是PCR反应中MgC12浓度和退火温度;反转录时间,循环条件对RT-PCR影响较小。     

PCR技术检测单核细胞增生李斯特氏菌研究进展

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患病致病菌.PCR技术是近年来被广泛地运用到食源性致病菌快速检测的分子生物学方法之一.就PCR技术检测单核细胞增生李斯特氏菌中的特异性鉴别基因、模板DNA制备等关键因素及多重PCR、巢式PCR、反转录PCR与定量PCR等主要技术进行了综述.     

链特异性RT-PCR方法检测口蹄疫病毒负链RNA

旨在建立一种快速、灵敏、特异的检测口蹄疫病毒在复制过程中产生的负链RNA的方法。根据口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)病毒5’-非编码区(5’-UTR)基因序列,设计了5条引物链特异性RT-PCR引物,建立检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法。提取FMD病毒RNA,应用设计的正向引物T1-H1做反转录引物,经反转录和RNA酶A消化后,再经两轮链特异性PCR扩增,可特异性地检测FMDV在复制过程中产生的负链RNA。所建立的检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法是一种可靠的方法,在确定细胞培养物和动物感染FMDV的病毒复制和了解病毒的致病性研究中具有应用前景。     

五指山小型猪不同器官内猪内源性反转录病毒的存在与表达

目的:检测五指山小型猪不同器官内猪内源性反转录病毒(PERV)的存在与表达情况。方法:提取心、肝、脾、肺、肾、胸腺等6种器官基因组DNA与总RNA,用PCR、反转录PCR对PERV结构基因gag、pol、env进行定性检测,用实时定量反转录PCR对pol基因进行相对定量检测。结果:6种器官中均能检测到PERV结构基因gag、pol、env的存在与表达;从m RNA水平上看,不同器官内pol基因的相对表达量不存在显著性差异。结论:五指山小型猪不同器官内PERV存在与表达的检测,对进一步阐明五指山小型猪来源的PERV分子生物学特性及深入评价猪-人异种移植病原安全性具有重要意义。     

马铃薯S病毒RT-PCR检测技术的研究

从感染PVS病毒的马铃薯病叶组织中提取出病毒的RNA,进行反转录cDNA的合成,用特异性引物进行PCR扩增,得到一条长度约为199 bp的特异性PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。在基因水平上为PVS的检测提供了一种快速、灵敏、简便的新方法,为PVS的防治提供了有效手段。     

一步多重PCR同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒研究

建立的一步ＰＣＲ方法即反转录和ＰＣＲ在同一管中进行,同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒病毒ＲＮＡ。实验中对不同的反转录温度以及一步多重ＰＣＲ的特异性和灵敏度进行了探讨。结果表明：４２℃、５０℃反转录时ｐｏｌｉｏ有非特异性条带出现,６０℃反转录特异性较好,而ＨＡＶ在三种不同的反转录温度下均得到牧场划性较好的条带;应用一步ＰＣＲ同时检测两种病毒与检测单一病毒的灵敏度基本一致,但在同等反应条件下后者的反应效率高于前者,特别是在检测ＨＡＶ时。     

Detection of <Emphasis Type="Italic">Brevipalpus</Emphasis>-transmitted viruses in their mite vectors by RT–PCR

The diagnosis of plant diseases caused by Brevipalpus-transmitted viruses (BrTVs) has been done through the analyses of symptoms, transmission electron microscopy, and RT–PCR of infected plant tissues. Here, we report the detection of Citrus leprosis virus C, Orchid fleck virus, Clerodendrum chlorotic spot virus and Solanum violaefolium ringspot virus in their viruliferous vectors Brevipalpus spp. using specific primer pairs for each of the viruses. The efficiency of virus transmission by Brevipalpus mites is low, so the detection of these pathogens in their vectors could constitute an important tool for studies involving virus-vector relationships, transmission, and monitoring the pathogen prior to the appearance of symptoms in the field.     

四种方法检测乙型肝炎病毒基因型的比较

目的比较四种方法检测乙型肝炎病毒基因型的差异性。方法对36例乙型肝炎患者的血清分别采用测序技术,荧光定量PCR技术,恒温扩增技术,基因芯片技术进行乙肝病毒基因型的检测。结果36份血清以测序技术为金标,观测荧光定量PCR技术特异性100%,敏感性83%,恒温扩增技术特异性100%,敏感性89%,基因芯片技术特异性100%,敏感度92%。结论目前临床采用的四种方法检测乙型肝炎病毒基因型的特异性相同,敏感度以测序为金标准,基因芯片技术最灵敏,其次为恒温扩增技术,最后为荧光定量PCR技术。     

数字PCR在新型冠状病毒检测中的应用前景

2020年,由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）导致的新型冠状肺炎（COVID-19）疫情在世界各国大规模爆发,导致全球公共卫生安全受到巨大影响。目前广泛采用的荧光定量PCR（RT-PCR）在检测SARS-CoV-2方面存在可能出现“假阴性”结果、需多次取样、重复检测等缺点,亟需建立一种灵敏度更高、样本用量少、操作简单的检测技术,以快速、准确、高效的筛选出新型冠状肺炎患者。数字PCR为新兴痕量核酸分子技术,具有灵敏度高、耐受性强、可绝对定量等优点,在病毒检测领域中广泛应用。介绍了SARS-CoV-2病原学特征和荧光PCR检测SARS-CoV-2目前存在的主要问题,并对数字PCR在SARS-CoV-2检测中的应用前景进行了具体阐述,以期为后续开发更高效的检测试剂盒、提高检测准确性提供方案。     

重组酶聚合酶扩增技术在植物病毒检测中的应用

随着分子生物学技术的发展,多种核酸等温扩增技术逐渐被开发出来。其中,重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)作为一种快速、灵敏的检测技术具有很大的优势。目前,RPA已应用于转基因生物、各类病原物及食品安全检测等多个领域,并作为新兴技术在植物病毒检测领域中快速发展。RPA技术只需一对引物,在恒温条件下(37-42℃)只需30 min左右即可完成反应,具有较高的灵敏度与特异性。因此,该技术正迅速成为一种能够用于条件有限的实验室或现场植物病毒检测的手段。本文介绍了RPA技术的检测原理、引物设计和应用方式,综述了其在植物病毒检测中的最新研究进展及存在的问题,为RPA技术在植物病毒检测中的应用提供参考。     

Molecular detection of a virus, Pilchard herpesvirus, associated with epizootics in Australasian pilchards Sardinops sagax neopilchardus

In 1995, and again in 1998, high mortalities of pilchards Sardinops sagax neopilchardus were seen over their entire geographical range on the Australian coastline. A virus with typical herpesvirus morphology was identified as the causative agent, although the source of the virus remains unknown. At the time of the mortality events, the only available diagnostic test available for the detection of the virus was electron microscopy and hence, development of a rapid diagnostic test for detection and identification of the virus was required. Initial sequence data for Pilchard herpesvirus (PHV) was acquired by comparing the highly conserved region of the ORF 62 gene of other piscine herpesviruses (Ictalurid herpesvirus 1 [Channel catfish virus, CCV] and Salmonid herpesvirus 2 [Oncorhynchus masou virus, SaHV2, OMV]), and designing primers that successfully amplified a fragment of PHV. Here we describe the use of polymerase chain reaction (PCR) technology to detect PHV in infected tissues. Sequence analysis of amplified fragment resulting from this PCR is different from all known herpesviruses and can therefore distinguish PHV from all known viruses.     

瓜类褪绿黄化病毒快速检测技术的引物筛选与体系优化

【目的】瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)是近年来发生的、由烟粉虱Bemisia tabaci半持久性传播的一种植物病毒,给瓜类作物带来严重经济损失。PCR扩增是检测该病毒的常用技术,但目前已报道引物对靶标生物的检测存在扩增结果不稳定、重复性不够的问题。本研究旨在通过筛选多对引物并优化PCR条件获得适合于稳定检测的引物及扩增体系。【方法】以携带有CCYV的根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101菌株菌液及其侵染获得的CCYV阳性黄瓜叶片cDNA为检测对象,从14对PCR引物中筛选出可用于稳定检测CCYV的引物,同时进行退火温度的优化;以携带有CCYV的根癌农杆菌侵染的阳性黄瓜叶片cDNA为模板,对筛选出来的4对引物及退火温度进行PCR扩增的稳定性和灵敏度检测;利用4对优选PCR引物对13份采自田间的烟粉虱成虫及寄主植物叶片的感毒状况进行检测和验证。【结果】从已报道的14对引物中筛选出4对引物可同时对携带CCYV的根癌农杆菌GV3101菌液及其侵染的CCYV阳性黄瓜叶片cDNA进行稳定扩增,并获得最优的扩增程序。灵敏度检测结果显示,优选的4对引物可检测到CCYV的最低黄瓜叶片cDNA浓度为0.25 ng/μL。利用优选的4对引物通过PCR对13份采自田间的烟粉虱成虫及其寄主植物叶片的CCYV检测发现,测试样本的CCYV阳性率为69.23%。【结论】优选的4对引物及其对应的优化扩增程序可用于对携带有CCYV的根癌农杆菌及其侵染的植物叶片以及田间样本是否感染CCYV的检测。     

电化学发光PCR技术检测转基因植物

随着转基因植物种类的增多,转基因植物的检测也成了当今的热门话题.电化学发光法是将电化学与化学发光两种高灵敏度方法相结合,实现了检测的高效、准确、无毒害.电化学发光PCR法首次将电化学发光技术、PCR技术和双探针杂交技术结合起来,用于检测CaMV(cauliflower mosaic virus)35 S启动子,从而判断其是否含有转基因成分.PCR产物与生物素标记的探针杂交,可以起到筛选的作用;与三联吡啶钌标记的探针杂交则可用于电化学发光检测.两种探针同时与转基因样品PCR产物杂交,使结果避免假阳性的影响而更加准确.实验表明：此方法可以准确地检测到35 S启动子的存在.该方法灵敏度高,可靠性强,操作简便,结果准确,有望成为一种高效的转基因检测方法.