甘草不同功能基因拷贝数多态性组合类型与叶片形态及甘草酸含量的相关性分析

目的:探讨甘草功能基因拷贝数多态性(CNV)与叶片形态特征及甘草酸含量的相关性,为筛选高品质甘草奠定基础。方法:以来自7个产地的60株甘草为实验材料,采用实时PCR对甘草中的3-羟基-3-甲基戊二酰Co A还原酶(HMGR)基因、鲨稀合成酶1(SQS1)基因和β-香树脂醇合成酶(β-AS)基因进行拷贝数测定,采用HPLC测定甘草酸含量,并考察不同功能基因CNV组合类型甘草叶片的形态特征。结果:根据实时PCR测定结果,按照3个功能基因的拷贝数,将甘草分为6种类型,即A型(β-AS+HMGR+SQS1=1+1+1)、B型(1+2+1)、C型(2+1+1)、D型(2+1+2)、E型(2+2+1)和F型(2+2+2);不同类型甘草在叶片形态特征方面存在显著性差异,A型与D型叶片的整体面积较小,而B型与E型叶片的整体面积则较大;HPLC测定结果显示B型甘草的甘草酸平均含量最高,E型甘草的甘草酸含量较高,而A型和D型的甘草酸含量则较低。结论:甘草中功能基因CNV组合类型与甘草叶片的形态特征及甘草酸含量之间存在明确的相关性,β-AS基因与SQS1基因单拷贝、HMGR基因双拷贝的甘草植株,其叶片具有最大的面积,同时其甘草酸含量最高。本研究结果可为优质甘草筛选奠定基础。     

HPLC法测定甘草酸和甘草苷的含量

目的:建立以HPLC法同时测定甘草中甘草酸和甘草苷含量的方法.方法:采用C18柱(4.6mmx15cm,5μm)为分析柱;以乙腈-1%醋酸溶液为流动相;流速为0.6ml·min-1;柱温25℃;采用外表法定量测定.结果表明甘草酸在4.16-28.0μg/ml范围内,回归方程为Y=10562.8X+30963(r=0.9999);甘草苷在13.0-23.4μg/ml范围内,回归方程为Y=12857.4X+16437(r=0.9997),平均加样回收率均大于96.08%,日内、日间的RSD值分别小于1.41%和1.85%.结论本方法操作简单、准确、快速、重现性好,其它组分干扰少,可用于甘草酸和甘草苷的含量测定.     

相同条件下的5种甘草中甘草酸含量的比较研究

通过双波长薄层扫描对同一生长环境下生长时间相同的5种甘草进行了甘草酸含量的分析、比较,并首次分析了采收时间对甘草中甘草酸含量的影响。同时通过HPLC法对刺果甘草进行了甘草酸的定性分析。为甘草的质量评价、采收时间及种间鉴别提供了依据。     

野生与栽培乌拉尔甘草不同部位甘草酸含量分析

采用超声提取法结合高效液相色谱(HPLC)对黑龙江省西部野生与栽培乌拉尔甘草不同部位的甘草酸含量进行测定,结果表明:超声方法提取甘草酸是便捷、有效的方法之一,最佳提取条件为50%甲醇提取液,超声提取45m in。甘草地下部分甘草酸含量较高,野生甘草的甘草酸含量主根 > 横根茎 > 不定根 > 垂根茎;栽培甘草则为不定根 > 主根 > 横根茎;总体上看地上部分甘草酸含量是微量的,其中叶的甘草酸含量相对较多,地上茎、种子等器官甘草酸含量较低。无论野生甘草还是栽培甘草, 10月份甘草地下部分甘草酸含量大于5月份,并且这种差别在栽培甘草中表现更明显。人工管理措施对甘草酸含量具有较大影响,野生甘草和栽培甘草经过土壤翻松和良好的田间管理模式反而使甘草酸含量下降,按种植农作物模式对栽培甘草进行管理对提升甘草酸含量效果不佳,给予一定的环境胁迫可以提高甘草酸的含量。在黑龙江省西部,野生甘草主根在1.0~2.0 m深度为甘草酸含量分布较高的部位;栽培甘草主根甘草酸含量随土壤深度的增加而增加,其根尾的甘草酸含量最高,表明栽培甘草主根尚未伸长到其甘草酸含量最高的土壤深度。     

甘草根中甘草酸的免疫组织化学定位研究

应用免疫组织化学定位和HPLC分析方法,对人工种植乌拉尔甘草根中的甘草酸分布和积累变化规律进行分析,以阐明药用甘草根在发育过程中甘草酸的积累变化规律,探讨甘草药材质量形成的内在机制。结果表明:(1)甘草酸主要分布在根的次生韧皮部薄壁细胞和维管射线细胞中,且主要积累在这些细胞的细胞壁上。(2)HPLC分析显示,主根的韧皮部中甘草酸含量最高,其次是木质部,根皮中含量最少。(3)甘草酸在主根中的含量随着生长年限的增加而提高,2、3年生甘草根中甘草酸含量上升较快,3年后甘草酸的含量达到3.66%,超过了国家药典规定的甘草酸含量标准。     

野生与栽培甘草不同部位甘草酸分布特点及其意义

研究了乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)不同部位的甘草酸分布特点及动态变化。野生及栽培甘草地下部分甘草酸含量较高, 其中不定根中甘草酸含量与主根接近。野生甘草与栽培甘草地下部分甘草酸含量的月变化规律相似, 且根茎中甘草酸含量比主根、不定根变化幅度大。在一个生长季中, 栽培甘草主根甘草酸以10月份含量最高, 表明秋末是最佳采收期。栽培甘草主根在1.0 m土壤深度甘草酸含量较高且有继续增加的趋势, 故直接播种方式种植甘草不利于根系采收, 造成资源浪费, 需要探索更有效的甘草栽培技术。     

野生与栽培甘草不同部位甘草酸分布特点及其意义

研究了乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis）不同部位的甘草酸分布特点及动态变化。野生及栽培甘草地下部分甘草酸含量较高,其中不定根中甘草酸含量与主根接近。野生甘草与栽培甘草地下部分甘草酸含量的月变化规律相似,且根茎中甘草酸含量比主根、不定根变化幅度大。在一个生长季中,栽培甘草主根甘草酸以10月份含量最高,表明秋末是最佳采收期。栽培甘草主根在1．0m土壤深度甘草酸含量较高且有继续增加的趋势,故直接播种方式种植甘草不利于根系采收,造成资源浪费,需要探索更有效的甘草栽培技术。     

人为扰动对乌拉尔甘草不同部位甘草酸与总黄酮含量的影响

人为扰动对甘草不同部位甘草酸含量和总黄酮含量均有较大的影响。即使是轻度的人为扰动 (土壤翻松 1次 )也会导致野生甘草的甘草酸含量明显下降 ,尤其对地下根茎 (兼有运输和储存功能 )中的甘草酸的积累影响最大。重度扰动栽培甘草各部位的甘草酸含量均较低 ,相对而言黄酮类物质的积累速率高于甘草酸 ,表明土壤扰动因素对甘草酸的形成与积累的影响大于总黄酮的形成与积累。无扰动野生甘草和轻度扰动野生甘草总黄酮含量从地上到地下呈下降趋势 ,而重度扰动栽培甘草的叶和不定根各有一个含量较高的部位 ,据此推断叶和不定根 (含毛状根 )是黄酮类物质的主要产生部位 ;具有输导功能的地上茎、复叶柄中总黄酮含量较低且波动较大。人为扰动对不同土壤深度甘草主根中甘草酸含量和甘草总黄酮含量的变化规律影响较小。无扰动野生甘草和轻度扰动野生甘草主根在 1.0～ 2 .0 m深度甘草酸含量分布较高是对该生境不同土壤深度长期适应的结果 ,而重度扰动栽培甘草主根可能尚未达到相应的土壤深度 ,因而表现为 1.0 m以下深层土壤中甘草酸含量较高。总之 ,旨在改善甘草生长条件的人为扰动对甘草酸和总黄酮的积累具有消极影响 ,适当的胁迫环境条件对提高药用植物的品质有益     

来源于羊痘病毒的白介素-18结合蛋白基因的表达和活性研究

近来,对白细胞介素18受体(IL-18R)及其转导机制的研究取得了较大进展。已经发现的与IL-18R有关的蛋白质有三种：第-种是IL-1受体相关蛋白(IL-1Rrp),即IL-18Rα,是IL-18R功的能性组分;第二种被称为辅助蛋白(AcPL),也即IL-18Rβ;第三种是IL-18结合蛋白(IL-18BP),其氨基酸序列与已知的细胞因子受体氨基酸序列均不同,可以在体外消除IL-18诱导的IFN-γ和IL-8的生成及对NFkB的激活。尽管IL-18BP与IL-18Rα没有同源性,结构也不相同,但是小鼠和人的IL-18BP均能抑制IL-18与其受体的结合。这表明,IL-18BP具有拮抗IL-18生物学活性的作用,是IL-18的拮抗剂。     

新疆胀果甘草内生菌的分离及产甘草酸菌株的筛选

目的：从甘草植株中分离其内生菌,并从中筛选出1株可以产甘草酸的菌株。方法：用PDA和LB等培养基,通过组织分离法和研磨分离法从甘草的根、茎、叶中分离甘草内生菌,将分离的内生菌发酵培养,其发酵液经薄层层析初筛及高效液相色谱定性及定量检测来获得产甘草酸的内生菌。结果：分离到237株甘草内生菌,其中129株为细菌,经鉴定属于13个属;108株为真菌,根据其形态特征,确定属于6个属。获得1株产甘草酸的内生菌,产量可达0.22mg/L。结论：甘草内生菌具有丰富的生物多样性,并能产生与宿主相同或相似生理活性代谢产物。     

宁夏乌拉尔甘草营养器官中甘草酸含量的动态变化研究

利用高效液相色谱（HPLC）法对宁夏中部干旱带半野生乌拉尔甘草营养器官中甘草酸含量的动态变化规律进行了研究.结果表明：地下营养器官（根和根状茎）是甘草酸主要积累部位,而地上茎和叶中甘草酸含量很低甚至检测不到.就地下器官而言,甘草酸的积累随生长年限增加而递增,且1～4 a生甘草均表现出主根中甘草酸的含量高于根状茎的规律.分别对3 a、4 a生的半野生甘草根和根状茎进一步研究发现,在一个生长季节中甘草酸含量的变化呈现相似的变化规律.即从7～10月份,甘草根和根状茎中甘草酸含量呈波动性上升趋势,10月份达到最大值.     

稀土元素对甘草细胞生长及甘草酸合成的影响

以胀果甘草根愈伤组织为材料,研究了在150mL摇瓶中,不同浓度的两种稀土离子镧、亚铈对甘草细胞生长及甘草酸分泌和释放的影响。结果表明,在悬浮培养初期、指数期加入稀土元素,改变了细胞生长状况,均使细胞在整体上生物量减少;不同种类的稀土离子、不同的稀土浓度对细胞生长影响强弱不同,但趋势相似。其中,培养指数期,加入500μL镧溶液的培养液中,所得甘草细胞生物量较多,利用薄层-紫外分光光度计法检测到甘草酸含量为67.68mg/g。     

超声提取-高效液相色谱法测定甘草中甘草酸含量

确定了制备甘草酸分析样品的超声波提取条件, 0.3%稀氨水为溶剂,液固比50:1,提取时间5 h;确定了高效液相色谱法检测甘草酸含量的条件为ODS色谱柱(4.6mm×25 cm, 5 μm),检测波长254 nm,检测温度为室温,流动相CH3OH/3% HOA c(V/V)为75/25,流速1mL/m in,进样量10 μL,平均加样回收率100.20%,相对标准偏差为1.77%。结果表明超声提取-高效液相色谱法是一种准确度高,速度快的测定甘草中甘草酸含量的检测方法。     

不同产地怀牛膝β-蜕皮甾酮含量测定及指纹图谱研究

建立怀牛膝中β-蜕皮甾酮的HPLC含量测定和指纹图谱方法,比较不同产地牛膝的质量差异。采用Waters SunFire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇和水为流动相,进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长250 nm。β-蜕皮甾酮在0.26μg～2.60μg线性关系良好(r=0.9994),平均回收率为100.29%(RSD=2.42%,n=6);建立了怀牛膝药材的HPLC指纹图谱,标定了怀牛膝药材中7个共有峰,并对21个不同产地的牛膝药材进行了测定。该方法简便、准确、重现性好,可为怀牛膝质量控制和道地性研究提供依据。     

复方甘草片HPLC指纹图谱及7成分测定

本文建立了复方甘草片的HPLC指纹图谱及吗啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸钠、异甘草苷、甘草酸7成分测定方法。采用50%甲醇水溶液对复方甘草片提取后,用HPLC-UV法进行测定;色谱条件为:Welch Ultimate AQ-C_(18)色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm);乙腈-0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.0)为流动相,梯度洗脱;流速1.0 mL/min;检测波长220、254 nm;柱温35℃;进样量10μL。采用国家药典委员会"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"(2012年版)建立18批样品指纹图谱,并同时测定7成分含量。结果显示18批复方甘草片指纹图谱相似度均大于0.95,共有27个共有峰,通过与对照品对照保留时间鉴定了14个共有峰。吗啡、磷酸可待因、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸钠、异甘草苷、甘草酸在各自浓度范围内线性关系良好(r0.999 0),平均加样回收率94.73%～104.45%,RSD 0.68%～3.89%。本方法简便、快速、准确,可用于复方甘草片的质量控制。     

不同产地生姜主要活性成分的比较分析北大核心CSCD

为全面评价生姜质量,通过GC-MS和HPLC法分别对不同产地生姜样品中挥发油和姜辣素进行比较分析。结果从9种生姜挥发油中分别鉴定了24~28种化学成分,占挥发油总量的85.31%~93.67%,主要为β-水芹烯(9.96%~20.15%)、莰烯(3.54%~14.53%)、柠檬醛(6.52%~12.49%)、β-柠檬醛(3.96%~7.44%)、姜烯(13.81%~19.74%)、姜黄烯(tr^5.52%)、β-倍半水芹烯(5.08%~6.22%)和β-红没药烯(2.63%~3.34%)等单萜和倍半萜类活性成分。9种生姜样品中6-姜辣素含量在0.067%~0.391%之间,均达到了现行中国药典不低于0.05%的规定。可见不同产地生姜主要活性成分含量差异较大。故以生姜的主要特征性有效成分姜烯、姜黄烯与6-姜酚共同作为其质量评价指标,将更加科学合理。     

甘草酸对巨噬细胞抗绵羊肺炎支原体感染的调控作用研究

为观察甘草酸在小鼠巨噬细胞系RAW264.7抗绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)感染中的作用,实验利用CCK-8细胞活性检测找到最佳甘草酸处理浓度;检测甘草酸对受MO感染的巨噬细胞活性的影响。流式细胞仪检测甘草酸对RAW264.7巨噬细胞生长周期的影响;ELISA检测甘草酸对受MO感染的巨噬细胞分泌TNF-α的影响;Western blot检测细胞凋亡因子Bax、Bad的表达情况。RT-PCR检测凋亡和自噬相关基因的表达情况。结果显示,浓度为12μmol/L的甘草酸显著升高RAW264.7的活性(P=0.012 9),且处于G1期的细胞数减少,G2期的细胞数增加。甘草酸(12μmol/L)可提高受MO感染的RAW264.7的增殖率(P=0.034 0),培养上清中TNF-α含量升高(P=0.015 2),巨噬细胞中促凋亡蛋白Bax表达量增加,但基因caspase 3和caspase 9的表达量显著下调(P<0.000 1),自噬相关基因Atg 7和Beclin 1表达量显著升高(P<0.000 1)。结果提示在MO感染巨噬细胞引起免疫抑制的情况下,甘草酸可通过促增殖、抑凋亡、促进TNF-α的表达、增加自噬来起到免疫调控作用。     

内生真菌Eupenicillium javanicum R57水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从10株东乡野生稻内生真菌中筛选到7株可转化京尼平苷合成京尼平的菌株,其中菌株R57的转化效率最高,最大转化率可达98.7%。通过菌体形态结合ITS rDNA、18S rDNA及28S rDNA序列分析,将该菌鉴定为爪哇正青霉Eupenicillium javanicum R57。菌株R57的粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、超滤、Ez Fast DEAE FF阴离子交换层析及Sephadex G-150凝胶柱层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶,其相对分子质量约为81k Da。该β-葡萄糖苷酶对京尼平苷和4-硝基苯基-β-D-吡南葡萄糖苷(PNPG)均有催化作用,但对京尼平苷的Km值最小,为0.153mmol/L,且催化效率更高;该β-葡萄糖苷酶具有较强耐酸性和耐热性,最适pH 4.6,最适温度60℃。该酶活性受K~+、Co~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Al~(3+)及尿素的激活,但受Cu~(2+)、Fe~(2+)、Mo~(3+)、Pb~(2+)及SDS不同程度的抑制。     

高效液相色谱法测定重组人干扰素α-2b注射液中乙二胺四乙酸二钠含量

目的:利用高效液相色谱(HPLC)法测定重组人干扰素α-2b注射液中EDTA二钠(乙二胺四乙酸二钠)的含量。方法:将EDTA二钠与氯化铁溶液于70℃水浴中反应20 min左右;色谱柱为SunFire C18(250 mm×4.6 mm,5μm,Waters),流动相为5%甲醇+95%0.64 g/L四丁基溴化铵和4.1 g/L三水合乙酸钠混合液,用冰乙酸调pH值至4.0,流速1 mL/min,检测波长254 nm。结果:该测定方法线性范围为0.025~0.5 g/L,线性关系良好(r=0.9997),加样回收率为98.27%(n=9,RSD=2.55%)。结论:本方法准确、快速、可靠,可用于重组人干扰素α-2b注射液中EDTA二钠含量的测定。     

高效毛细管电泳法测定甘草中甘草酸的含量

采用高效毛细管电泳法成功地分离测定了甘草中甘草酸的含量, 在pH=5.8 的50mmol/L 磷酸缓冲液, 检测波长252nm, 分离电压25KV, 进样压力20 mm 汞柱, 温度30℃的检测条件下, 标准溶液在0.0448mg/ml~0.224mg/ml 范围内与峰面积成良好的线性关系, 回归方程为:Y=4.16×10⁶x-8.94×10⁴, 相关系数r=0.9939, 具有较高的灵敏度和准确度。该法操作简便、迅速、可靠、测试费用低。