自噬抑制剂3-MA上调H2O2损伤的PC12细胞氧化应激水平

为探究自噬抑制剂6-氨基-3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）对损伤细胞氧化应激水平的影响,将3-MA作用于H2O2诱导的PC12细胞损伤模型,以自噬增强剂雷帕霉素（rapamycin,Rap）作为对照,探讨自噬与氧化应激的关系。测定线粒体的膜电位和细胞内的活性氧（reactive oxygen species, ROS）与丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,评价损伤细胞的氧化应激状态。单丹(磺)酰戊二胺（monodansylcadaverine,MDC）染色,观察损伤细胞的自噬情况。蛋白质印迹分析损伤细胞中的自噬相关蛋白质LC3-II/LC3-I比值变化。实验结果显示：与正常组相比,H2O2损伤细胞的ROS水平上升到正常组的141%,MDA含量增加(P<0.001);CAT与SOD酶活力显著降低(P<0.001),差异均有统计学意义,证明损伤细胞氧化应激水平增加;MDC染色结果表明,H2O2组自噬明显增加。Western印迹结果表明,LC3-II/LC3-I值显著升高（P<0.05）;与损伤组相比,3-MA组MDC染色结果表明,自噬水平降低。Western印迹结果表明,LC3-II/LC3-I值下降;细胞内ROS水平升高,增加到正常组的208%。MDA含量增加(P<0.001),CAT、SOD酶活力降低(P<0.001)。综上结果表明,自噬抑制剂可增加H2O2诱导的PC12细胞损伤模型的氧化应激水平,增加细胞凋亡。     

番鸭呼肠孤病毒感染诱导细胞自噬的研究

本研究通过透射电镜观察自噬体的形态学结构,蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞自噬相关蛋白LC3II和磷酸化mTOR(p-mTOR)表达量的动态变化趋势,探索番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染对细胞自噬的影响。结果显示,MDRV-YB株感染的DF-1细胞中可见典型的包裹胞浆成分的双层膜结构;MDRV感染番鸭成纤维细胞(MDFs)和DF-1细胞后0~60h内,其LC3II表达量均呈现先升高后降低的趋势,且均在感染后36h达到最大值,其p-mTOR表达量均呈现先降低后回升的趋势,且分别在感染后36h和24h达到最低值;灭活MDRV组细胞未见LC3II表达。结果表明MDRV能够诱导感染的MDFs和DF-1细胞持续较长时间细胞自噬,而灭活的MDRV不能引起细胞自噬。     

紫檀芪通过激活自噬缓解脊髓神经元细胞氧化应激损伤的作用及其机制

自噬在保护脊髓神经元细胞氧化应激损伤中具有重要的作用。紫檀芪(pterostilbene,PTE)是具有抗氧化作用的天然植物的提取物,但其对神经元细胞的作用及其机制尚不清楚。该文采用CCK-8分析PTE对大鼠原代脊髓神经元细胞的细胞毒性;不同浓度PTE作用神经元细胞24 h和48 h,透射电镜和Western blot检测微管相关蛋白轻链3-II(microtubule-associated protein 1 light chain3-II,MAP1LC3-II)、Beclin-1和P62蛋白质水平并分析自噬水平。PTE处理H2O2作用下的神经元细胞24 h,Western blot检测LC3-II水平,GFP-LC3转染观察自噬的数量。2′,7′-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(2′,7′-dichloro-djhydrofl uorescein diacetate,DCFDA)和Mito SOX染色分析细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,自噬相关基因5(autophagy related gene 5,ATG5)si RNA转染分析自噬在其中的作用。结果显示,20μmmol/L PTE对于神经元细胞无细胞毒性,PTE作用下神经元细胞中LC3-II、Beclin-1蛋白质水平呈剂量依懒性升高,而P62则呈剂量依懒性下降(P0.05)。PTE增加H2O2作用下的神经元细胞中LC3-II蛋白质水平(P0.05),自噬体数量增加,PTE可提高神经元细胞中自噬体数量。PTE明显降低神经元细胞中ROS水平,但ATG5 si RNA转染抑制自噬后显著逆转PTE的保护作用。该研究结果提示,PTE可能通过提高氧化应激状态下的脊髓神经元细胞自噬水平来抑制细胞ROS的产生。     

神经胶质瘤U251细胞氧化损伤中自噬和凋亡过程的时间顺序

目的：探讨过氧化氢（H2O2）诱导神经胶质瘤U251细胞损伤中自噬和凋亡发生的时间顺序。方法：实验分为4组：正常对照组、1mmol／L H2O2作用（6h、12h、24h）组。应用MTF法检测H202对神经胶质瘤U251细胞生存率的影响;MDC染色检测自噬空泡的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。Western blot检测Beclin1和胞浆cyt c蛋白的表达。结果：与对照组相比,1mmol／L H2O2作用下,U251细胞存活率明显降低,并呈时间依赖性。与对照组相比,1mmol／L H2O2作用后,6h时U251细胞自噬空泡明显增加,自噬相关蛋白Beclin1表达明显增加,12h、24h细胞自噬水平逐渐增强;而6h时未见细胞凋亡率明显变化及cyt c由线粒体向胞浆的释放,12h、24h时细胞凋亡率明显增加,胞浆中cyt c蛋白表达明显增强（P〈0．05）。结论：氧化损伤能够诱导神经胶质瘤U251细胞发生自噬和凋亡,并且自噬发生于凋亡之前。     

氧化低密度脂蛋白通过Wnt5a/PKCδ信号通路诱导大鼠肝星状细胞自噬

该文旨在研究氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)自噬的影响及机制,探讨非酒精性脂肪肝炎的发病机理。体外培养的HSC-T6细胞以不同质量浓度(0、10、20、40、60μg/mL)的ox-LDL分别处理不同时间(0、3、6、12、24 h)后,用Western blot检测LC3 II、Beclin1、p62的含量。不同质量浓度(0、10、20、40、60μg/mL)的ox-LDL处理HSC-T6细胞12 h后,Western blot检测Wnt5a、p-PKCδ、p-STAT3的含量。将HSC-T6细胞分为对照组(Control)、ox-LDL组、ox-LDL+si-NC组和ox-LDL+si-Wnt5a组,经相应处理后用Western blot、qRT-PCR分别检测LC3 II、Beclin1、p62、p-PKCδ、p-STAT3的蛋白和mRNA含量变化;免疫荧光检测LC3 II的变化;油红O染色观察HSC-T6脂滴含量变化;比色法检测各组细胞培养上清中羟脯氨酸(Hyp)含量;ELISA检测细胞培养上清中透明质酸(HA)和层黏连蛋白(LN)含量。PKCδ抑制剂Rottlerin预处理细胞:将HSC-T6细胞分为对照组(Control)、ox-LDL组、ox-LDL+DMSO组和ox-LDL+Rottlerin组,检测方法与敲低Wnt5a一致。经ox-LDL处理后,HSC-T6细胞中LC3 II、Beclin1含量增加(P<0.05),p62含量减少(P<0.01),且在ox-LDL质量浓度为20μg/mL、作用12 h时达到峰值。ox-LDL质量浓度为20μg/mL、作用12 h时,HSC-T6细胞中Wnt5a、p-PKCδ、p-STAT3蛋白表达显著升高(P<0.01)。敲低Wnt5a后,HSC-T6细胞中Wnt5a、LC3 II、Beclin1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.001),p62蛋白表达增多(P<0.01),p-PKCδ、p-STAT3蛋白表达减少(P<0.05),细胞内LC3 II点状聚集减少,脂滴含量减少,细胞培养上清中Hyp、HA、LN含量也减少(P<0.05)。抑制PKCδ后,结果与敲低Wnt5a一致。ox-LDL可通过增强Wnt5a/PKCδ通路诱导HSC-T6细胞自噬。     

花旗松素通过激活Nrf2/HO-1/HIF1α/Autophagy信号通路对H_2O_2所致H9C2细胞氧化应激保护作用的研究

氧化应激(oxidative stress,OS)是缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)的主要发病机制之一,抗氧化应激损伤是防治缺血性心肌病的关键。为了探讨花旗松素(taxifolin,tax)对过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导的大鼠心肌细胞H9C2氧化应激的影响及其可能的分子机制,将培养的H9C2心肌细胞随机分为对照组(Control)、氧化应激组(H_2O_2)、tax预处理组(tax+H_2O_2)、tax单独处理组(tax)。通过观察细胞形态的改变,检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的生成、自噬体自噬泡的形成,以及自噬(autophagy)相关蛋白质LC3 I/II、p62的表达,验证tax对氧化应激及自噬的影响。同时,通过检测Nrf2、HO-1、HIF1α的表达,研究可能存在的分子机制。研究发现tax可缓解H_2O_2诱导的H9C2细胞氧化应激,表现为细胞肥大形态缓解、ROS生成降低、MDA产生减少,而且Nrf2/HO-1/HIF1α蛋白的表达升高,自噬水平升高。实验结果表明:tax可能通过激活Nrf2/HO-1/HIF1α/Autophagy信号通路促进自噬及抗氧化应激,从而发挥心肌保护作用。     

PC12细胞在缺氧条件下的自噬现象

目的：考察PC12细胞内自噬发生与缺氧时间的关系,探讨自噬对缺氧细胞的影响作用。方法：以PC12细胞为模型,将对数生长期的细胞加入96孔培养板,37℃、5% CO₂培养24 h后,放入0.5% O₂、94.5% N₂和5% CO₂的培养箱缺氧1 h、3 h、6 h、9h、12 h、24 h、36 h和48 h,用MTT法检测细胞存活率,透射电镜观察细胞内自噬体,Westen blot法检测自噬相关蛋白（LC3B、Atg5和Beclin1）的表达,用试剂盒检测细胞内乳酸脱氢酶（LDH）活性、活性氧自由基（ROS）和线粒体膜电位（MNP）水平,探究缺氧不同时间自噬对PC12细胞的作用。结果：在缺氧3~12 h,PC12细胞自噬明显增加,自噬相关蛋白（LC3B、Atg5和Beclin1）表达增加,尤其是缺氧9 h,PC12细胞存活明显增加,表明短时间缺氧自噬对细胞起保护作用,而随着缺氧时间的延长细胞存活明显降低,自噬相关蛋白表达水平减少,细胞LHD和ROS水平明显增加。MMP水平显著下降,细胞凋亡明显增加。结论：在缺氧早期自噬对PC12细胞起保护作用,但缺氧时间较长,超过了细胞自身调节能力导致细胞死亡。     

脂多糖通过mTOR途径抑制肝细胞脂质自噬

本研究旨在探讨脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对肝细胞脂质自噬的影响及其机制。体外培养人肝癌细胞株HepG2,用0.1 mmol/L软脂酸(palmitic acid, PA)负荷,分为对照(0μg/mL LPS)组、LPS (10μg/mL)组、LPS+DMSO组、LPS+雷帕霉素(rapamycin, RAPA, 10μmol/L)组。油红O染色观察HepG2细胞内脂质积聚情况;自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3转染细胞后激光共聚焦显微镜观察细胞自噬流;通过氟硼二吡咯BODIPY 493/503荧光染料和溶酶体标记物溶酶体关联膜蛋白1 (lysosomal associated membrane protein 1, LAMP1)进行脂滴和溶酶体的共定位,反映细胞内脂质自噬水平;Western blot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、p-mTOR、核糖体S6激酶1 (ribosome protein subunit 6 kinase 1,S6K1)、p-S6K1、LC3II/I、P62蛋白表达。结果显示,与对照组相比,LPS组细胞油红O染色红染脂滴增加,自噬体增加,自噬溶酶体明显降低,LAMP1/BODIPY共定位率降低(P 0.05),p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1和LC3II/LC3I比值升高,P62蛋白表达增加(P 0.05)。加入RAPA干预后,与LPS+DMSO组相比,自噬体减少,自噬溶酶体明显增加,LAMP1/BODIPY共定位率升高(P 0.05),肝细胞油红O染色红染脂滴减少(P 0.001)。综上,LPS通过激活mTOR通路抑制HepG2细胞脂质自噬,从而加重细胞内脂质积聚。     

自噬对氧化应激引起的脊髓神经元细胞损伤的作用及其机制

氧化应激是脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脊髓神经元细胞继发性损伤的重要机制,但是如何缓解氧化应激目前仍然不明确。该文培养SD(Sprague Dawley)大鼠原代脊髓神经元细胞,使用不同浓度的H-2O_2作用于神经元细胞12 h后,Western blot检测LC3-II、Beclin-1和P62蛋白质水平变化,分析自噬水平,电镜和绿色荧光蛋白标的记微管相关蛋白轻链3(green fluorescent proteinmicrotubule-associated protein 1 light chain 3,GFP-LC3)转染观察自噬的数量。ATG5 si RNA转染抑制自噬和雷帕霉素(rapamycin)促进细胞自噬,并使用CCK-8和TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling)染色分析自噬对氧化应激下神经元细胞的作用。结果显示,随着H-2O_2浓度增加,LC3-II和Beclin-1蛋白质水平显著升高,而P62蛋白质水平显著下降(P0.05)。透射电镜和共聚焦观察发现,10、50μmol/L H-2O_2可以增加神经元细胞中自噬体的数量。与对照组比较,H-2O_2明显抑制神经元细胞的活力(P0.05),ATG5 si RNA抑制自噬水平后,H-2O_2作用下的细胞活力进一步下降,而雷帕霉素促进自噬后却可以提高细胞的活力(P0.05)。TUNEL和膜联蛋白V/PI(annexin V/PI)染色结果发现,雷帕霉素可以抑制H-2O_2引起的神经元细胞凋亡(P0.05)。该研究结果提示,脊髓神经元细胞处于氧化应激状态下时,自噬代偿性激活并保护神经元细胞。     

大负荷运动诱导大鼠骨骼肌损伤对其自噬超微结构及Beclin1和LC3-II/I的影响*

目的: 观察大负荷离心运动对大鼠骨骼肌自噬超微结构及自噬相关蛋白Beclin1和LC3II/I的影响。方法: 48只SD雄性大鼠适应性训练后随机分成对照组(C,n=8)和大负荷离心运动组(E,n=40)。E组于跑台进行90 min下坡跑,运动后0 h、12 h、24 h、48 h和72 h取比目鱼肌,透射电镜观察其自噬体超微结构变化;Western blot检测Beclin1和LC3II/I蛋白表达;免疫荧光观测LC3的定位及含量变化。结果: E组比目鱼肌自噬体数量在运动后0 h、12 h和24 h均有增加,并伴LC3自噬荧光明显增强(P＜0.01),同时运动后48 h自噬荧光仍有显著性升高(P＜0.05);Beclin1和LC3II/I在大负荷离心干预后表达升高(P＜0.05),运动后12 h～24 h达到峰值(P＜0.01),直至运动后72 h完全恢复。结论: 大负荷离心运动可诱导骨骼肌自噬超微结构变化,自噬蛋白表达增强,以上可能是运动损伤的骨骼肌功能下降的原因之一。     

白藜芦醇通过抑制自噬相关蛋白LC3 Ⅰ/Ⅱ和beclin-1表达促进H_2O_2处理的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对H_2O_2处理的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS)影响及自噬相关蛋白的表达。方法取RA患者血清检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)活性,CCK-8法观察不同浓度H_2O_2对RA-FLS增殖的影响,TUNEL染色观察不同浓度Res对H_2O_2处理的RA-FLS凋亡的影响,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3 I/II(LC3 I/II)和beclin-1蛋白表达水平。结果 RA患者MDA含量升高,总SOD活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性降低;5μmol/L H_2O_2能促进RA-FLS增殖,Res能剂量依赖性的促进5μmol/L H_2O_2处理的RA-FLS凋亡,降低LC3 I/II和beclin-1水平。结论 RA患者机体处于氧化应激状态,低浓度H_2O_2能促进RAFLS增殖,Res可抑制RA-FLS增殖和促进凋亡,其机制可能与降低自噬蛋白LC3 I/II、beclin-1表达有关。     

克柔假丝酵母菌通过Dectin-1/Syk信号通路活化巨噬细胞自噬

目的探究Dectin-1/Syk信号通路在克柔假丝酵母菌激活RAW264.7细胞自噬中的作用。方法以特异性抗体封闭RAW264.7细胞表面TLR-2、TLR-4及Dectin-1受体,免疫蛋白印记检测克柔假丝酵母菌刺激后LC3II的表达量;通过白皮杉醇及Raf-1抑制剂分别阻断RAW264.7细胞Syk及Raf-1磷酸化,观察对克柔假丝酵母菌激活细胞自噬的影响;采用SiMi Transfection Reagents转染Atg5siRNA,检测不同时间段RAW264.7细胞对克柔假丝酵母菌的杀菌率。结果封闭细胞膜Dectin-1、阻断Syk磷酸化显著抑制克柔假丝酵母菌诱导RAW264.7细胞LC3II的表达,而封闭细胞膜TLR-2或TLR-4,以及阻断Raf-1磷酸化对于克柔假丝酵母菌刺激下LC3II的表达无显著影响。敲低Atg5后RAW264.7细胞在感染6h后对克柔假丝酵母菌的杀菌率显著降低。结论 Dectin-1/Syk信号通路介导了克柔假丝酵母菌激活RAW264.7细胞自噬,并且自噬功能参与了该细胞对克柔假丝酵母菌的杀灭作用。     

抑制Beclin1促进H2O2诱导的神经胶质瘤U251细胞凋亡

氧化应激能够引起细胞自噬和凋亡同时发生,但其中细胞自噬的作用仍不十分明确,研究表明Beclin 1作为调节前自噬体形成的关键基因,参与了胶质瘤氧化应激的损伤过程.为了探讨自噬在H2O2引起的神经胶质瘤U251细胞损伤中的作用,本文应用真核细胞转染技术将Psilencer3.1-siRNA-Beclin 1重组质粒转入人...     

甘丙肽2型受体对氧化应激海马神经元自噬的调控作用及机制研究

本研究旨在解析仔猪脑海马甘丙肽2型受体(galanin receptors type 2,GALR2)参与氧化应激调节的分子机制.本研究基于成功构建的仔猪活体和大鼠海马神经元氧化应激模型,采用实时PCR技术考察仔猪脑海马和大鼠海马神经元GALR2的表达变化.并采用实时PCR、蛋白质印迹法及透射电镜技术进一步探索GALR2介导的信号途径和自噬之间的关系.结果发现,与对照组相比,氧化应激仔猪脑海马与大鼠海马神经元GALR2的转录水平上调(P0.01;P0.05).同时,氧化应激神经元自噬相关基因LC3、ATG5与Beclin-1的转录水平均上调(P0.05;P0.05;P0.01).相关性分析结果显示,GALR2与LC3、ATG5及Beclin-1的转录水平正相关(P0.05;P0.05;P0.01). GALR2特异性抑制剂M871的处理降低氧化应激海马神经元的活力(P0.01)、抑制氧化应激引起的自噬小体数量增多(P0.01)、自噬相关基因LC3、Beclin-1及ATG5转录水平的上调(均P0.01)以及LC3-Ⅱ/β-actin比值与P62蛋白质水平的升高(均P0.05),表明伴随GALR2表达水平的抑制,被氧化应激上调的海马神经元自噬效应被抑制,从而削弱对氧化损伤的抵抗,降低了神经元的活力.与此同时,M871的处理也降低了被氧化应激上调的JNK蛋白表达量(P0.01)及磷酸化水平(P0.05),表明JNK是GALR2调控海马神经元氧化应激的下游靶酶.而JNK特异性抑制剂SP600125的处理则下调了被氧化应激上调的自噬标记蛋白LC3-Ⅱ/β-actin比值(P0.01),表明氧化应激状态下,抑制的JNK阻碍了神经元中上调的GALR2对自噬信号通路的激活.综上可见:氧化应激状态下,海马神经元中上调的GALR2可通过调节JNK信号途径激活细胞自噬途径,从而降低神经元的氧化应激损伤,保护神经元.     

自噬相关蛋白LC3Av1和LC3B在大鼠牙髓炎中的表达研究

目的研究自噬相关蛋白LC3Av1和LC3B在大鼠实验性牙髓炎组织中的表达。方法 30只8周龄SD大鼠左侧下颌第一磨牙开髓,封入大肠埃希菌LPS(5μg/μL)棉球,玻璃离子封闭髓腔。分别于开髓后0、6、12、24和48h处死大鼠,分离下颌骨。组织学处理后,HE染色观察牙髓组织炎症状况,免疫组织化学染色SP法检测LC3Av1和LC3B的表达及分布。结果正常牙髓组织中LC3Av1和LC3B少量表达。实验组中,LC3Av1在12、24和48h时表达量较0、6h时显著增高,差异具有统计学意义(P0.01);LC3B在6、12h时表达量较0、24和48h时增高,差异具有统计学意义(P0.05);两种蛋白表达分布均集中于成牙本质细胞及多细胞层中的成纤维细胞。结论自噬相关蛋白LC3Av1和LC3B在牙髓组织中的表达随炎症发展增加,提示自噬作用可能与牙髓炎的发生发展相关。     

骨髓瘤细胞中阿霉素诱导的ATP 变化与自噬的关系

目的:检测用阿霉素(doxorubicin DOXO)处理的骨髓瘤细胞株NCI-H929中ATP与自噬表达水平的变化,探讨两者之间的关联。方法:分别以DOXO 2umol/l 24h、DOXO 2umol/l联用自噬抑制剂3MA 10mmol/l 24h处理H-929细胞后,采用MTT法检测细胞存活率;ATP生物发光法检测ATP表达量;Western Blot检测靶细胞自噬标志分子LC3蛋白的表达。结果:各组相对未处理组存活率分别为54%、35%;相对未处理组%ATP分别为400%、150%;DOXO 24h LC3表达显著上调。结论:经DOXO处理H-929细胞系自噬形成,进而ATP上升以保护细胞。     

左旋卡尼汀对脂多糖诱导小鼠肺微血管内皮细胞自噬和凋亡的影响*

目的:探讨左旋卡尼汀(LC)对脂多糖(LPS)损伤的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)的保护作用及自噬、凋亡的影响。方法:采用体外培养的小鼠PMVECs,分为对照组(Control组)、LPS组(10 μg/ ml,3、6、12、24 h)、LPS(10 μg/ ml,24 h)+LC(终浓度为2.5、5、10 μg/ml)(LC组)。Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡,细胞免疫荧光染色法检测自噬小体,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3及凋亡蛋白Caspase-3的含量,CCK-8法检测细胞活力。结果:① 与Control组比较,LPS 6 h、12 h、24 h组PMVECs细胞活力显著受到抑制,细胞凋亡率、自噬蛋白LC3Ⅱ表达显著增高(P均＜0.01),LC3蛋白阳性表达。②与LPS 24 h组比较,各浓度LC组PMVECs细胞活力显著提高、自噬蛋白LC3II表达水平显著升高(P均＜0.01),而PMVECs凋亡率和凋亡蛋白Caspase-3表达水平均明显降低 (P＜0.05)。结论:LC具有提高LPS刺激的小鼠PMVECs活性、促进PMVECs自噬、抑制凋亡的作用。     

骨髓瘤细胞中阿霉素诱导的ATP变化与自噬的关系

目的：检测用阿霉素（doxorubicin DOXO）处理的骨髓瘤细胞株NCI-H929中ATP与自噬表达水平的变化,探讨两者之间的关联。方法：分别以DOXO 2umol/l 24h、DOXO 2umol/l联用自噬抑制剂3MA 10mmol/l 24h处理H-929细胞后,采用MTT法检测细胞存活率;ATP生物发光法检测ATP表达量;Western Blot检测靶细胞自噬标志分子LC3蛋白的表达。结果：各组相对未处理组存活率分别为54%、35%;相对未处理组%ATP分别为400%、150%;DOXO 24h LC3表达显著上调。结论：经DOXO处理H-929细胞系自噬形成,进而ATP上升以保护细胞。     

缺氧通过SIRT1调控结直肠癌细胞自噬

目的:探究缺氧调控结直肠癌细胞自噬的分子机制。方法:分别在常氧及缺氧(1%氧气浓度)条件下处理细胞,western blot检测细胞内沉默信息调节因子1(Silencing Information Regulator 1,SIRT1)及自噬相关标志分子的表达情况;慢病毒转染构建SIRT1稳定过表达或敲减细胞株,利用透射电镜观察细胞内自噬体形成的情况;使用m RFP-GFP-LC3双标腺病毒感染细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞自噬流的进展。结果:Western blot结果显示,缺氧条件下,HCT116及SW480细胞内SIRT1的表达水平随着缺氧时间的延长而降低,自噬特异性底物p62蛋白水平降低且LC3-I/II转换增加;与对照组相比,SIRT1过表达细胞内自噬特异性底物p62的表达水平升高而LC3-I/II转换受到抑制;相反在SIRT1敲减细胞内,p62的表达水平降低而LC3-I/II转换进一步促进。透射电镜结果发现SIRT1过表达后,细胞内自噬溶酶体形成减少、自噬体数量增多;激光共聚焦结果显示,SIRT1过表达细胞内绿色荧光淬灭减少、自噬体与自噬溶酶体的融合收到明显抑制,说明SIRT1通过抑制自噬溶酶体的形成,阻断自噬流的进展。结论:缺氧通过抑制SIRT1的表达促进结直肠癌的细胞自噬。     

氯喹抑制自噬增强宫颈癌细胞SiHa对CPT处理的敏感性

自噬诱导是肿瘤细胞对化疗药物抵抗性的原因之一,该研究探讨溶酶体抑制剂氯喹对喜树碱(camptothecin,CPT)诱导的宫颈癌细胞Si Ha死亡的增敏效果。CPT和/或氯喹处理宫颈癌Si Ha细胞,MTT法检测细胞增殖,DAPI和TUNEL染色观察细胞凋亡,Western blot和免疫荧光检测自噬及凋亡相关蛋白。结果发现,CPT处理后,Si Ha细胞MAP1LC3B荧光点和LC3II(microtubuleassociated protein light chain 3II)蛋白水平增加,p62荧光点和蛋白质水平则减少;而采用氯喹特异抑制自噬后,可明显提高CPT诱导的细胞凋亡、caspase-9的激活和PARP(poly ADP-ribose polymerase)的切割,而全长caspase-2水平显著下降。以上结果提示,氯喹可通过抑制细胞自噬而增强宫颈癌细胞株Si Ha对CPT诱导细胞凋亡的敏感性。