五龙鹅MHC ClassⅠ基因克隆及同源建模研究

主要组织相容性复合体(MHC)与动物机体对外源性抗原的免疫应答之间存在关联。从GenBank/DDBJ/EMBL基因库中读取鸡、其他鸟类、爬行类和哺乳类的MHC ClassⅠ基因进行序列分析设计引物, 使用LA-PCR法从五龙鹅的基因组中克隆了MHC ClassⅠ基因序列(DNA序列和mRNA序列GenBank登录号分别为: AM114925和AM114924), 并分析其基因组结构。运用生物信息学技术对测序结果进行分析显示: 基因组DNA由8个外显子和7个内含子组成, 与鸡基因序列同源率为60.8%~64.1%, 与人的同源率为42.9%。分子进化树进一步揭示了五龙鹅与鸡、其他鸟类、爬行类、哺乳类以及人类的进化关系, 同源建模分析发现该基因由氨基末端结构域和羧基末端结构域构成。     

番鸭呼肠孤病毒YB株σB蛋白的基因序列分析及其原核表达

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)是造成雏番鸭高死亡率的重要病原体,深入其检测与免疫研究对于防控DRV感染意义重大。利用RT-PCR和测序技术,对3株福建DRV分离株的S3基因进行序列分析,发现DRV-YH、YJL株与禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)遗传距离较近,同源性高达94.6%～98.9%,而DRV-YB株与ARV同源性仅为60.6%～61.7%。构建和鉴定DRV YB株重组原核表达质粒pET-30a-S3,并转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE表明,表达的目的蛋白分子量约为42ku,IPTG最适诱导浓度为0.1mM,最适诱导时间为5h,最适诱导温度为37℃,以包涵体形式存在。薄层扫描显示重组DRVσB蛋白占菌体总量的67.7%。以Ni 2+柱亲和层析纯化蛋白,纯化后的目的蛋白纯度为93%,质量浓度为0.86g/L。Western blot分析该融合蛋白能与抗DRV阳性血清发生特异性反应,表明重组DRVσB蛋白具有良好的免疫反应性。     

禽白血病重组毒FJ15TH0株不同感染方式对SPF鸡感染状态及组织病毒载量的影响

为揭示禽白血病病毒(ALV)自然重组毒FJ15TH0感染SPF鸡群的不同方式对其感染状态和病毒组织分布的影响,本研究设计动物试验分别模拟垂直传播和生长早中期水平传播,动态检测各组病毒血症、泄殖腔排毒、抗体反应及不同内脏组织病毒载量,为制定地方鸡群中ALV感染的防控和净化措施提供可靠的流行病学依据。结果表明胚内接种模拟垂直传播组除2只实验鸡外均产生免疫耐受,持续带毒排毒而无抗体产生;1日龄和D组均未表现泄殖腔排毒,在接触病毒后2~3w后C组63.6%实验动物表现一过性病毒血症,D组未表现病毒血症,暴露后5~11w期间C组9.1%~25%鸡出现一过性血清抗体,D组在暴露后3~5w期间14.3%~42.8%实验鸡产生一过性血清抗体。11w时剖杀实验鸡,荧光定量RT-PCR检测各组各实验鸡不同组织的gp85mRNA及病毒粒子的基因组RNA含量,结果显示垂直感染组表现泄殖腔排毒者gp85检测均为阳性,该分离株对肾脏和法氏囊的组织亲嗜性最强,而对肝脏和脾脏的亲嗜性较低;而同居感染组实验鸡均表现为gp85mRNA检测阴性,表明该重组毒水平感染能力较弱。     

大鼠背根神经节同一分离神经元膜受体电生理学及细胞神经递质免疫组织化学检测方法

在新鲜分离的大鼠背根神经节（ＤＲＧ）神经元应用全细胞膜片钳技术记录并证实了膜受体的存在,然后将此同一细胞吸入一较大口径的微吸管,再转移至载玻片上,在倒置显微镜下完成细胞的固定、漂洗及免疚组织化学抗原－抗体反应和显色等步骤。应用这一方法成功地在单个ＤＲＧ神经元膜上确证了Ｎ－甲基－Ｄ－天冬氨酸及Ｐ物质自身受体的存在。     

致蛋鸡血管瘤J亚群禽白血病病毒cDNA全序列分析

【目的】了解近年来我国商品蛋鸡群中以血管瘤为主要表型的J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus subgroup J,ALV-J)的分子生物学特性,为控制ALV-J在鸡群中流行提供基础资料。【方法】采用PCR扩增和序列分析技术,对分离自血管瘤或者血管瘤与髓样细胞瘤(Myeloid Leukosis,ML)并存的3株蛋鸡ALV-J毒株前病毒DNA的全序列及3株商品蛋鸡血管瘤型分离毒和1株商品蛋鸡ML型分离毒的致瘤关键性序列进行研究。【结果】来自血管瘤或者血管瘤与ML并存的商品蛋鸡分离毒株与来自肉鸡分离毒株的全序列差异明显,在遗传进化树上分属两个大的分支;研究发现商品蛋鸡血管瘤及ML混合病例分离毒JS09GY3与JS09GY6株的引物结合位点(Primer Binding Site,PBS)-Leader中出现极为罕见的连续19bp的插入突变,其与劳斯相关病毒1(Rous Associated Virustype1,RAV-1)、劳斯相关病毒2(Rous Associated Virustype2,RAV-2)及劳斯肉瘤病毒施密特-鲁宾二氏[Rous sarcoma virus(strain Schmidt-RuppinB),RSV-SRB]毒株序列相同;通过对U3区调控元件的分析,发现血管瘤商品蛋鸡病例分离毒NHH与JS09GY5的U3区各发生1处连续序列缺失,出现了极为独特的c-Est-1、TCF11及C/EBP结合位点,这些调控元件可能与病毒的致肿瘤特性相关;所测的5株血管瘤商品蛋鸡分离毒均保留完整E元件,而所有肉鸡分离毒的E元件均发生了几乎相同的大部分序列缺失;首次发现血管瘤商品蛋鸡分离毒JS09GY3的E元件中有11bp的连续插入序列。【结论】商品蛋鸡血管瘤型ALV-J与肉鸡分离毒在全序列上差异明显,U3、DR1和E元件等区域有一部分特殊的突变与毒株的宿主类型和肿瘤表型有一定关系,其功能尚需进一步研究。而血管瘤型、髓细胞瘤型ALV-J可能是ALV-J与其它反转录病毒的重组毒。     

CNTFRα在ALV自然重组FJ15HT0株感染宿主过程中的表达

本团队之前分离到一株天然重组禽白血病病毒(ALV)毒株FJ15HT0,经RNA-seq分析发现该毒株感染会引起鸡胸腺组织中睫状神经营养因子受体α(CNTFRα)基因表达量上调.为进一步探究CNTFRα在ALVFJ15HT0株感染过程中的表达及作用,本研究在构建ALV先天感染模型的基础上,通过RT-qPCR和免疫组织化学染色(IHC)探究不同时间点CNTFRα在感染鸡肝脏和胸腺中的表达量变化;以RT-qPCR和Western Blot检验病毒的复制水平对DF-1细胞CNTFRα在转录水平和蛋白表达水平的影响.结果表明,感染组与空白组相比,鸡胚出壳率明显降低,鸡只体重极显著降低(P＜0.01);RT-qPCR和IHC结果显示同一时间点感染组胸腺和肝脏组织中CNTFRα转录水平及蛋白表达量均极显著高于空白组(PP＜0.01),胸腺组织中CNTFRα基因相对表达量与病毒gp85基因相对表达量呈极显著正相关关系(r=0.633,P＜0.01);14d、21d感染组鸡只血清C.NTF含量显著高于空白组(P＜0.05).RT-qPCR和Western Blot检测结果表明84 h感染组DF-1细胞CNTFRα表达量随病毒复制水平增加而显著提高(P＜0.05),CNTFRα基因与病毒gp85基因相对表达量呈极显著正相关关系(r=0.73,P＜0.01),CNTFRα蛋白与p27蛋白的表达量呈极显著正相关关系(r=0.973,P＜0.01).研究表明CNTFRα可能参与ALV FJ15HT0株致病过程.     

P物质对大鼠分离的DRG细胞GABA激活电流的抑制作用

本文就用全细胞膜片箝技术,在新鲜分离的大鼠ＤＲＧ细胞上证明,在部分细胞Ｐ物质（１０＾－７－１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ）可引起浓度依赖性的内向流（４／２６）;在多数细胞虽未检测到ＳＰ引起的膜电流,但却能对ＧＡＢＡＡ受体激活介导的膜内向流产生抑制效应（１８／２２）,并有加速去敏感的作用。本文就有关ＳＰ以ＧＡＢＡ激活电流抑制效应的可能意义进行了讨论。     

番鸭源传染性支气管炎病毒PTFY株的分离鉴定

为弄清楚2009年7月某种番鸭养殖场产蛋高峰期番鸭产蛋率、孵化率降低,蛋质量下降的原因,选择无呼吸道症状,死亡率低,剖检可见卵巢肿大充血的番鸭。为确诊该病例,进行病原体的分离与鉴定。取病番鸭卵巢组织,通过鸡胚接种实验、脂溶剂敏感实验、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)干扰试验、电镜观察和动物接种实验进行病毒分离和鉴定。结果表明:接种鸡胚可导致侏儒胚,该毒株对于脂溶剂敏感,胰酶处理后具血凝性,可干扰NDV复制,电镜下可见典型冠状病毒形态,接种雏鸡可致呼吸道症状,针对N基因部分序列的扩增与分析可见该毒株与传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)参考毒株相应核苷酸序列同源性为84.7%~99%,鉴定所分离毒株PTFY株为IBV,证实IBV对番鸭具有致病性。     

基于高通量测序技术分析番鸭呼肠孤病毒感染雏番鸭肠道转录组学的变化

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)感染雏番鸭可导致肠道黏膜受损,造成肠黏膜免疫功能低下甚至丧失。为寻找番鸭呼肠孤病毒感染雏番鸭肠道组织免疫相关的差异表达基因,本研究建立番鸭呼肠孤病毒自然发病模型,在感染后3d、6d、21d采集同居感染组和对照组试验雏番鸭的空肠,对其进行高通量测序,对差异表达基因进行GO功能分类和KEGG数据库分析。结果显示,感染后3d、6d和21d分别筛选出2 297、5 860和3 721个差异表达基因;GO分子功能结果显示,免疫相关差异表达基因主要和免疫球蛋白的产生、T细胞活化和单核细胞趋化性等有关;KEGG通路富集结果显示,差异表达基因主要涉及在吞噬体、细胞溶质DNA传感途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路和RIG-I受体信号通路;荧光定量RT-PCR对差异表达基因进行验证,其结果与转录组学结果基本一致。本研究为进一步阐明MDRV感染导致雏番鸭肠道损伤和黏膜免疫抑制的机制奠定基础。     

番鸭呼肠孤病毒感染诱导细胞自噬的研究

本研究通过透射电镜观察自噬体的形态学结构,蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞自噬相关蛋白LC3II和磷酸化mTOR(p-mTOR)表达量的动态变化趋势,探索番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染对细胞自噬的影响。结果显示,MDRV-YB株感染的DF-1细胞中可见典型的包裹胞浆成分的双层膜结构;MDRV感染番鸭成纤维细胞(MDFs)和DF-1细胞后0~60h内,其LC3II表达量均呈现先升高后降低的趋势,且均在感染后36h达到最大值,其p-mTOR表达量均呈现先降低后回升的趋势,且分别在感染后36h和24h达到最低值;灭活MDRV组细胞未见LC3II表达。结果表明MDRV能够诱导感染的MDFs和DF-1细胞持续较长时间细胞自噬,而灭活的MDRV不能引起细胞自噬。