巢式甲基化特异性PCR检测肺癌病人WIF-1基因启动子区异常甲基化

为了检测肺癌患者血浆中WIF-I基因启动子区的甲基化状态,收集肺癌患者及健康对照者的血浆标本,采用巢式甲基化特异性PCR（nMSP）法检测WIF-I基因启动子区甲基化状态,并与普通甲基化特异性PCR（MSP）法进行了比较,结果在58例肺癌患者血浆样品中经nMSP法发现20例WIF-I基因启动子的过甲基化,用MSP法只检出10例,有吸烟史组WIF-1基因的甲基化率高于无吸烟史组（P〈0．05）．而20例正常对照血浆中都未检测到形胆J基因启动子的过甲基化;表明利用巢式MSP（nMSP）法检测外周血血浆中WIF-1基因启动子的甲基化,可为非损伤性筛选和早期诊断肺癌提供有价值的信息．     

骨肉瘤中RASSF1A基因的甲基化状态研究

目的：分析骨肉瘤组织中RASSF1A基因甲基化状况。方法：运用甲基化特异性PCR（MSP）分别检测44例骨肉瘤组织及相应的癌旁组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态并分析其临床病理意义。结果：骨肉瘤组织中RASSF1A基因异常甲基化率（61.4%）显著高于癌旁正常骨组织中RASSF1A基因的异常甲基化率（20.5%）,二者之间差异具有统计学意义（P〈0.05）。RASSF1A基因异常甲基化导致组织中RASSF1A基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低。另外,RASSF1A基因异常甲基化和肿瘤组织分化程度及全身有无转移情况有相关性（P值分别为0.022和0.016）,而与患者年龄、性别、肿瘤位置及大小等临床特征无关（P值分别为0.6944,0.977,0.786和0.831）。结论：RASSF1A基因启动子高甲基化可能是导致其在骨肉瘤中表达水平降低的分子机制之一,有望成为骨肉瘤早期辅助诊断的一个重要分子标志物。     

APP基因启动子区甲基化与冠心病相关性的研究

为了探讨淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)基因甲基化与冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease, CHD)之间的关系,采用甲基化特异性实时定量聚合酶链反应(quantitative methylation-specific PCR, qMSP)检测538名CHD患者及453名正常对照者的APP甲基化修饰水平。结果显示:CHD组的年龄、男性人数、吸烟及糖尿病患者人数均高于对照组(年龄, P=8.0E-08;男性人数, P=7.0E-07;吸烟, P=0.001;糖尿病,P=0.019)。CHD组患者白蛋白水平显著低于对照组(P=0.001),而AST、ALP及γ-GT的水平在CHD组中显著高于对照组(AST, P=3.0E-04; ALP, P=0.001;γ-GT, P=0.018)。在总体样本及男性样本中, APP基因甲基化水平在CHD组显著高于对照组(总体, P=0.026;男性, P=0.025)。在非吸烟CHD患者中, APP基因甲基化水平与狭窄程度呈正比(r=0.076, P=0.046)。在总体CHD伴高血压患者及男性CHD伴高血压患者中, APP基因甲基化水平和狭窄程度呈正比(总体, r=0.096, P=0.029;男性, r=0.135, P=0.019)。年龄分层分析后发现,在年龄≥63岁的男性CHD伴高血压患者中, APP基因甲基化水平与狭窄程度呈正比(r=0.219, P=0.020)。在年龄63岁的不吸烟或非高血压CHD患者中, APP基因甲基化水平与狭窄程度呈负相关(不吸烟, r=-0.223, P=0.008;非高血压,r=-0.216, P=0.010)。在男性CHD患者中, APP基因甲基化水平与年龄呈正相关(r=0.163, P=0.001)。在女性CHD患者中, APP基因甲基化水平与年龄呈负相关(r=-0.192, P=0.015)。在男性正常对照组中, APP基因甲基化水平与年龄呈负相关(r=-0.203, P=0.001)。在女性正常对照组中, APP基因甲基化水平与ApoB、白蛋白及ALT水平呈负相关(r=-0.160, P=0.028; r=-0.151, P=0.036; r=-0.163, P=0.024)。在正常对照组中, APP基因甲基化水平与Lp(a)水平呈正相关(r=0.108, P=0.031)。以上结果初步表明APP基因甲基化水平增高可能和男性CHD患病风险有关。     

巢式甲基化特异性PCR检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化

为了检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子的甲基化状态,收集肝细胞癌患者及健康对照者的血清标本,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化状态.结果肝细胞癌患者血清样品中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化率为53.12%和31.25%,68.75%的患者血清可以检测到异常甲基化,正常对照血清中未检测到RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化,RASSF1A和CDH13基因甲基化与患者的临床病理资料无明显相关性(P>0.05);表明nMSP法检测血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化具有较高的敏感性,可为肝细胞癌的筛查、早期诊断和预后判断提供有价值的信息.     

类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞 IL-10 基因启动子甲基化状态研究

白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）是在类风湿性关节炎中发挥重要免疫调节作用的细胞因子,其基因失活与已分化的Th1和Th2细胞染色质结构重塑有关。为了探讨IL-10基因启动子甲基化及基因失活在类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)发病和进展中的作用,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及甲基化特异性聚合酶链反应(MSP), 分别检测34例类风湿性关节炎患者和30例健康人外周血单个核细胞 IL-10 mRNA、蛋白表达水平及基因启动子甲基化状态。结果显示,病例组IL-10 mRNA及蛋白表达均低于健康对照组,无统计学差异（P>0.05）。病例组甲基化率(85.29%)高于健康对照组(43.33%), 具有统计学差异(x² =12.439,P=0.000)。IL-10基因启动子甲基化状态与其mRNA表达呈显著负相关(r=-0.579, P=0.001), 与所累关节数显著相关,但与血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子(RF)、年龄均无相关性(P>0.05)。IL-10 mRNA表达与年龄、所累关节数、ESR、CRP及RF均无相关性(P>0.05)。上述结果提示,启动子甲基化可能是IL-10基因失活的重要机制,IL-10基因异常高甲基化状态可能参与了RA的发生发展。     

骨肉瘤中RASSF1A基因的甲基化状态研究

目的:分析骨肉瘤组织中RASSF1A基因甲基化状况。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)分别检测44例骨肉瘤组织及相应的癌旁组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态并分析其临床病理意义。结果:骨肉瘤组织中RASSF1A基因异常甲基化率(61.4%)显著高于癌旁正常骨组织中RASSF1A基因的异常甲基化率(20.5%),二者之间差异具有统计学意义(P<0.05)。RASSF1A基因异常甲基化导致组织中RASSF1A基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低。另外,RASSF1A基因异常甲基化和肿瘤组织分化程度及全身有无转移情况有相关性(P值分别为0.022和0.016),而与患者年龄、性别、肿瘤位置及大小等临床特征无关(P值分别为0.6944,0.977,0.786和0.831)。结论:RASSF1A基因启动子高甲基化可能是导致其在骨肉瘤中表达水平降低的分子机制之一,有望成为骨肉瘤早期辅助诊断的一个重要分子标志物。     

结肠癌组织RASSF1A基因转录表达和启动子区甲基化研究

目的:研究Ras相关区域家族1A基因(ras association domain family 1A,RASSF1A)启动子区甲基化对结肠癌组织中该基因转录和表达的影响.方法:应用甲基化特异性PCR(Methylation-special PCR,MSP)、RT-PCR和Western blot方法检测30例结肠癌组织和癌旁组织中的RASSF1A基因启动子区甲基化状态、mRNA和蛋白表达水平.结果:①RASSF1A基因启动子区在结肠癌纽织和正常组织中的甲基化频率分别为57%(17/30)和20%(6/30),甲基化频率在两组具有统计学差异(p＜0.01),,结肠癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化频率显著高于癌旁正常组织(x2=8.531,p＜0.01);②结肠癌组织中RASSF1A基因mRNA和蛋白袁达均显著低于癌旁组织(癌组织和癌旁正常组织中mRNA相对表达量分别为0.2836±0.0493和0.5092±0.0433,P＜0.001;以上组织中蛋白相对表达量分别为0.3124±0.0472和0.5320±0.0440,P＜0.01);③在结肠癌组织中,甲基化组RASSF1A基因mRNA和蛋白表达明显低于非甲基化组(甲基化组和非甲基化组mRNA相对表达量分别为0.0686±0.0174和0.5511±0.0486,P＜0.0001;以上组中蛋白相对表达量分别为0.1219±0.0326和0.5614±0.0380,P＜0.0001).结论:结肠癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化明显增高,与该基因蛋白表达减少显著相关,这可能是导致结肠癌中RASSF1A抑癌基因失活的主要因为.     

有氧运动上调Agtr1a基因甲基化改善高血压肠系膜动脉ACE1-AT1R收缩轴功能

血管紧张素Ⅱ 1A受体(angiotensin Ⅱ type 1A receptor, AT1aR)是Ang Ⅱ的主要受体亚型。AT1aR基因(Agtr1a)启动子区DNA甲基化水平的变化是调控AT1aR表观遗传的重要机制。为明确运动是否通过调节Agtr1a基因启动子区甲基化水平而减弱ACE1-AT1R收缩轴功能,从而起到改善高血压血管功能的作用,本研究选用3月龄自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)和正常血压对照组大鼠(Wistar-Kyoto, WKY),随机分为正常血压安静组WKY-C、正常血压有氧运动组WKY-E、高血压安静组SHR-C、高血压有氧运动组SHR-E,各组n=24。12周跑台运动结束后,有氧运动显著减低运动组大鼠血压和体重(P0.05);采用微血管环张力测定技术测定肠系膜动脉对去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)的反应性。结果显示,有氧运动显著减弱高血压大鼠肠系膜动脉对血管收缩因子NE、AngⅡ的收缩反应(P0.05);高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定血浆中ACE1-AT1R收缩轴主要活性肽血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)、AngⅡ的水平。结果显示,有氧运动显著减弱高血压大鼠肠系膜动脉对血管收缩因子NE、AngⅡ的收缩反应(P0.05);免疫印迹法和q-PCR技术测定肠系膜动脉ACE1、AT1R蛋白质和AT1aR的mRNA水平相对含量。结果显示,有氧运动显著降低高血压大鼠肠系膜动脉ACE1、AT1R蛋白质和AT1aR mRNA水平(P0.05);亚硫酸氢盐测序BSP法测定Agtr1a基因的启动子区甲基化水平。结果显示,有氧运动显著上调高血压大鼠肠系膜动脉Agtr1a基因启动子区甲基化水平(P0.05)。本研究表明,有氧运动通过上调高血压肠系膜动脉Agtr1a基因启动子区甲基化水平,即而减弱RAS系统ACE1-AT1R收缩轴功能,从而抑制高血压血管张力增高,缓解血压增高。     

基于TCGA数据库结肠癌RBL1基因甲基化水平的诊断与预后分析

视网膜母细胞瘤样蛋白1(RBL1/p105)是视网膜母细胞瘤蛋白质家族的成员之一,RBL1通常被认为是抑癌基因,在细胞增殖、凋亡、分化中发挥重要作用。该文探讨RBL1基因在结肠癌诊断和预后中的作用和可能的机制。利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库中的结肠癌病例资料和芯片数据,筛选RBL1基因差异甲基化位点,并通过Cox回归模型研究甲基化位点与结肠癌患者预后之间的关系。该研究发现,待研究的癌组织RBL1基因启动子甲基化水平高于癌旁组织(0.120±0.012 vs 0.113±0.008, P=0.000 04)。随后,研究者采用受试者工作特征(ROC)曲线来评价RBL1基因启动子甲基化水平的诊断价值,用曲线下面积(AUC)作为诊断价值的评判标准。研究发现,启动子区甲基化的AUC达到0.732,对应的灵敏度为80.5%、特异度为55.3%。Cox多因素分析结果发现, cg04086771高甲基化是结肠癌患者预后的独立危险因素(P=0.002)。该研究通过对TCGA数据库的挖掘,发现RBL1基因启动子区甲基化均值可能与结肠癌发病风险有关,同时RBL1基因的甲基化位点的甲基化水平对结肠癌的预后有影响。     

脑胶质瘤组织中p16基因启动子区CpG岛甲基化检测及其临床意义研究

目的：研究脑胶质瘤中p16基因启动子区甲基化情况及其临床意义。方法：用甲基化特异性PCR技术检测42例脑胶质瘤组织和癌旁正常脑组织中p16基因启动子甲基化,并分析该基因启动子甲基化与临床病理特征之间的关系。结果：脑胶质瘤组织中p16基因异常甲基化率（38.27%）显著高于癌旁正常脑组织中p16基因的异常甲基化率（8.8%,P=0.000）。发生甲基化的肿瘤组织或者正常脑组织中p16基因mRNA和蛋白表达显著降低。此外,p16基因异常甲基化和肿瘤病理分级有相关性（P=0.007）,而与患者性别、年龄及肿瘤类型等临床特征无关（P=0.669,0.869和0.944）。结论：p16基因启动子区CpG岛高甲基化与p16表达下调相关,推测p16启动子区CpG岛高甲基化是导致p16基因在脑胶质瘤中表达下调的重要因素,有望成为脑胶质瘤早期辅助诊断的分子标志物之一。     

原发性肝癌ATM基因启动子甲基化及其与放疗疗效的相关性

为探究原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxia-telangiectasia mutated gene, ATM)启动子甲基化情况,分析其与临床特征的关系及与放疗疗效的相关性,采用甲基化特异性PCR法(methylation-specific PCR, MSP)检测50对肝癌手术标本及相应的癌旁肝组织标本、20例正常肝组织、38例局部中晚期肝癌肝穿刺标本的ATM基因启动子甲基化状态,并采用BSP (bisulfite sequencing PCR)测序法对样本的甲基化状态进行验证,分析ATM基因启动子甲基化状态与患者临床特征的关系及与放疗疗效的相关性。结果发现, 88例肝癌组织中ATM基因启动子甲基化率为39.8%(35/88),其中38例肝癌肝穿刺标本有42.1%(16/38)存在ATM基因启动子甲基化, 50例肝癌手术标本有38%(19/50)存在ATM基因启动子甲基化,相应癌旁肝组织只有8.0%(4/50)存在ATM基因启动子甲基化;正常肝组织未发现有ATM基因启动子甲基化, ATM基因启动子甲基化在肝癌组织中的发生率与癌旁肝组织、正常肝组织相比差异具有统计学意义(χ2=24.818,P0.05)。此外,存在ATM基因启动子甲基化的局部中晚期肝癌患者的放疗疗效显著优于无甲基化的病例(χ2=5.955,P=0.015), ATM基因启动子甲基化状态与肝癌放疗疗效呈显著正相关关系(r=0.396, P=0.014)。实验结果表明原发性肝癌ATM基因启动子存在异常甲基化, ATM基因启动子甲基化状态与肝癌放疗疗效关系密切,可为筛选放射敏感差异病人提供新的思路。     

生长因子颗粒蛋白前体和肿瘤坏死因子受体基因启动子区改变与阿尔茨 海默病的相关性研究

目的:探讨生长因子颗粒蛋白前体(PGRN)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因启动子区改变以及全基因组DNA甲基化与阿尔茨海默病的相关性。方法:收集阿尔茨海默病患者血液样本80例以及健康对照血液样本80例,PCR扩增PGRN和TNFR基因启动子区并进行测序,观察两组间的单核苷酸多态性位点是否有差异。同时,用甲基化特异性PCR法检测启动子区DNA甲基化情况以及用ELISA法检测全基因组DNA甲基化水平。结果:在TNFR基因启动子区域发现阿尔茨海默病和对照组之间在多态性位点rs4149570和rs4149569有显著性差异(P0.001和P=0.033)。阿尔茨海默病患者全基因组甲基化水平为(0.79±0.29)%,显著低于对照组的(1.00±0.36)%(P0.001)。结论:TNFR基因多态性位点rs4149570和rs4149569的变异可能与阿尔茨海默病相关,全基因组甲基化水平降低可能与阿尔茨海默病相关。     

卵巢上皮癌中ING4基因启动子的甲基化状态及其临床意义

目的：探讨卵巢上皮癌中ING4基因启动子的甲基化状态及其临床意义。方法：收集2005年7月至2012年6月哈尔滨医科大学附属第一医院行全面分期手术并经病理检查确诊的150例卵巢上皮癌组织标本,并以同期因子宫肌瘤或子宫腺肌症行子宫全切除术或次全切除术并经病理检查确诊为正常卵巢组织的150例标本作为对照组。采用甲基化特异性PCR（MSP）技术检测卵巢上皮癌组织与正常卵巢组织中ING4基因启动子的甲基化状态,蛋白印迹法检测1NG4蛋白的表达,并分析ING4基因启动子的甲基化状态与卵巢上皮癌临床病例特征的关系。结果：卵巢上皮癌组织中ING4基因启动子的甲基化阳性率为42．7％（64／150）,明显高于正常卵巢组织（4％,6／150）,差异有统计学意义（P〈0．05）。ING4基因启动子甲基化阳性的卵巢上皮癌组织中ING4蛋白表达阴性或弱阳性;1NG4基因启动子甲基化阴性的卵巢上皮癌和正常卵巢组织中ING4蛋白表达阳性;在64例1NG4基因启动子甲基化的卵巢上皮癌组织中,ING4蛋白表达强度与ING4基因启动子的甲基化程度呈负相关（r=-0．435,P〈0．05）。卵巢上皮癌组织中,1NG4基因甲基化的阳性率随着手术病理分期和组织学分级的增加而增加（P〈0．05）;卵巢透明细胞癌（55．6％,10／18）和卵巢子宫内膜样癌（59-3％,16／27）中ING4基因甲基化的阳性率显著高于浆液性囊腺癌（33．9％,20／59）和粘液性囊腺癌（39．1％,18／46）（P〈0．05）;ING4基因启动子的甲基化状态与患者的年龄、有无腹水及淋巴结转移均无显著相关性（P〉0．05）。结论：ING4基因启动子的甲基化可能促进了其在卵巢上皮癌组织中的表达失活,进而促进了卵巢上皮癌的生长和分化。     

白血病患者骨髓中RASSF1A基因启动子甲基化状态及其临床意义

目的:通过检测各类型白血病骨髓中RASSF1A基因启动子区甲基化水平,探讨其对白血病分型的临床检测意义。方法:抽选93例不同类型白血病患者(观察组)予以甲基化特异性PCP(MSP)方法进行骨髓RASSF1A基因甲基化状态检测,研究不同类型白血病甲基化状态差异,同期抽选93例非白血病者为对照研究(对照组)。结果:观察组中有13例(13.98%)检测到RASSF1A基因甲基化,而对照组中RASSF1A基因甲基化率为0%,比较差异显著(P0.05)。不同类型白血病RASSF1A甲基化率比较:淋巴系显著高于髓系(P0.05),急性与慢性白血病比较差异无显著性(P0.05)。结论:白血病骨髓中MSP法检测存在RASSF1A甲基化;而RASSF1A基因在淋巴系白血病中的甲基化概率明显增高,因此,对RASSF1A进行甲基化检测有可能作为白血病临床诊断分型的生物学指标之一。     

RG108对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及RASSF1A基因表达的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂RG108对人肺腺癌细胞株A549增殖、凋亡以及对RASSF1A（Ras as-sociation domain proteinfamily1）基因启动子区域甲基化状态、表达的影响。方法用20μmol/L的RG108对A549细胞进行化学干预72h,用MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞术检测细胞周期以及凋亡情况;RT-PCR观察RASSF1A基因mRNA水平变化;Western blot检测RASSF1A蛋白的表达;甲基化特异性PCR（MS-PCR）检测RASSF1A基因启动子区域甲基化状态的改变。结果经RG108干预72h后,A549细胞的抑制率为17.2±0.43%,细胞周期阻滞于G0/G1期,并引起细胞凋亡。RT-PCR和Western blot结果显示在干预组细胞中分别出现RASSF1A基因的DNA条带（329bp）和蛋白质条带（39kD）,而对照组中无相应条带出现。RASSF1A基因启动子区域由甲基化状态转变为非甲基化状态。结论RG108可使RASSF1A基因启动子区域去甲基化,并通过该机制诱导RASSF1A基因在人肺腺癌细胞株A549中表达。     

血清S100β,内皮素-1和血管内皮生长因子测定在老年认知功能障碍疾病诊断中的意义

目的:老年认知功能障碍尤其老年轻度认知功能障碍的早期诊断仍有一定的困难,本研究通过观察血清Sl00β,内皮素-1(ET-1)和血管内皮生长因子(VEGF)测定在老年认知功能障碍疾病诊断的意义.方法:选取2008年10月～2012年4月对我院的认知功能障碍的患者117例,其中阿尔茨海默病患者(AD组)55例和轻度认知功能障碍患者(MCI组)有62例.选取同期在我院体检的健康老年志愿者(对照组)20例.分别检测血清S100β,ET-1,VEGF和蒙特利尔认知评分(MoCA).结果:血清S100β和ET-1水平,从AD组,MIC组和对照组依次降低,而VEGF水平和MoCA评分依次升高,差异有统计学意义(P＜0.01).AD组患者血浆S100β,ET-1与MoCA评分存在负相关(r=-0.387,r=-0A08,P＜0.05),AD组患者血浆VEGF与MoCA评分呈正相关(r=0.363,P＜0.05);而MIC组患者血浆Sl00β,ET-1,VEGF水平与MoCA之间无明显相关性(P＞0.05).结论:S100β,ET-1和VEGF参与老年认知功能障碍的形成过程,血浆S100β,ET-1水平与AD的病情正相关,血浆VEGF与AD的病情成负相关,对于早期发现MCI,和检测AD疾病的病情具有重要意义.     

Fibulin3基因在非小细胞肺癌中的蛋白表达及甲基化检测

目的:检测Fibulin3基因在非小细胞肺癌患者(non-small cell hung cancer,NSCLC)组织中的表达和甲基化状态,并分析其临床病理意义.方法:收集59例NSCLC患者术后病理蜡块,进行免疫组化染色;提取癌组织及相应癌旁组织DNA,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测Fibulin3基因启动子区甲基化情况.结果:59例NSCLC标本中,25例(42.4%)Fibulin3表达水平比相应癌旁组织下调(P＜0.05);癌组织和相应癌旁组织甲基化22例和5例检出Fibulin3基因启动子区高甲基化,其阳性率分别为37.3%和8.5%,差异具有统计学意义(P＜0.001);Fibulin3启动子甲基化导致蛋白表达下调或缺失(P＜0.001),并与临床分期(P=0.035)及淋巴结转移(P=0.011)相关.结论:启动子甲基化引起的Fibulin3基因失活在NSCLC发生发展中起重要作用,Fibulin3启动子甲基化可能成为NSCLC早期诊断和预后评估的潜在标记物.     

NDRG2基因启动子甲基化与肺腺癌细胞中mRNA表达相关性的实验研究

目的:探讨肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子甲基化状态及其与基因表达的关系。方法:甲基化焦磷酸测序技术检测启动子区域甲基化状态,荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下培养细胞中NDRG2基因mRNA的表达水平,分析启动子区域甲基化与基因表达之间的关系。结果:在体外培养细胞中检测到NDRG2基因启动子区域呈现不同程度的甲基化,甲基化频率分别为肺癌A549细胞71.8%、GLC-82细胞86.1%、人脐静脉内皮ECV-304细胞36.8%、胃上皮GES-1细胞42.9%。NDRG2基因mRNA表达与其启动子甲基化程度成反比,甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用于细胞后,A549和GLC-82细胞中NDRG2基因的mRNA转录明显上调,至72 h差异显著(P0.05)。结论:肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子CpG岛存在高甲基化,甲基化程度与该基因的表达具有负相关性,5-Aza-CdR能在一定程度上提高NDRG2的转录水平。     

肝细胞癌中FHIT基因启动子甲基化状态分析及其与临床病理特征之间的关系研究

目的:分析肝细胞癌组织中FHIT基因启动子甲基化状态及其与FHIT基因表达和肝细胞癌临床病理特征的关系。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)方法分析肝细胞癌组织和癌旁正常肝脏组织中FHIT基因启动子甲基化状况;应用RT-PCT和Western免疫印迹方法检测FHIT基因mRNA和蛋白的表达情况;统计学分析FHIT基因启动子甲基化与肝细胞癌临床病理特征的关系。结果:MSP分析结果表明肝细胞癌组织中FHIT基因甲基化率(60.8%)显著高于癌旁正常组织中FHIT基因甲基化(16.2%;x2=31.071,P=0.000)。同时我们还发现:发生完全或者部分甲基化的肝细胞癌组织或者癌旁正常肝组织中FHIT基因mRNA和蛋白表达水平显著降低。FHIT基因启动子甲基化和肝细胞癌患者的临床分期和肝外转移情况密切相关(P=0.006和0.049),而与其他临床病理特征无相关性(P>0.05)。结论:FHIT基因甲基化是导致FHIT基因在肝细胞癌中失活的一个重要因素,与肝细胞癌的发生密切相关,有望成为肝细胞癌早期诊断的分子检测标志物和分子治疗新靶点。     

腺苷酸环化酶3缺失对小鼠主要嗅觉表皮组织内DNA甲基化的影响

腺苷酸环化酶3 (adenylate cyclaseⅢ,AC3)是嗅觉系统中的重要成分,AC3缺失后小鼠的主要嗅觉表皮组织(main olfactory epidermal,MOE)随年龄增长逐渐变薄,MOE内基因表达谱发生改变. DNA甲基化在动物发育、基因表达调控中具有重要作用.为了探讨AC3缺失后小鼠MOE内基因启动子甲基化水平的改变以及对基因表达的影响,本文采用DNA甲基化免疫共沉淀芯片(methylated DNA immunoprecipitation chip,MeDIP-chip)筛选AC3缺失小鼠MOE内启动子区甲基化差异表达基因,利用甲基化特异PCR (methylation-specific PCR,MSP)、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)进一步检测部分甲基化差异基因的DNA甲基化水平改变和表达差异.结果表明,AC3缺失小鼠中有1 978个基因启动子的甲基化水平发生了改变,占总探针数的9%,其中727个基因启动子甲基化水平升高,1 251个甲基化水平降低.功能分析表明,这些启动子甲基化发生改变的基因主要涉及的功能分别与嗅觉受体、神经发育、cAMP信号通路、ATP结合、钙离子调控、乙酰化修饰、转录因子等相关. MSP检测表明,嗅觉受体基因Olfr1153、Olfr231、Olfr378、Olfr651、Olfr691启动子区的甲基化水平升高,Cngb1、Pde4a和Olfr1394基因启动子区的甲基化水平降低. qRT-PCR结果显示,基因Cngb1、Hcn4、Olfm1、Olfr1394、Olfr1153、Olfr231、Olfr378、Olfr691的表达水平显著下降,而Pde4a和Olfr651基因的表达水平显著升高.总之,AC3缺失后MOE内嗅觉受体基因、神经发育相关基因、cAMP信号通路等相关基因启动子甲基化水平发生显著改变,影响核苷酸切除修复、DNA复制、错配修复等信号通路的传导,从而综合调控小鼠MOE内的基因表达数量和水平.