RNAi在害虫防治中应用的重要进展及存在问题

RNAi是目前最有可能应用于害虫绿色防控的新技术。2017年6月,美国环境署(EPA)批准了国际上第一例表达昆虫双链RNA(dsRNA)的抗虫转基因玉米MON87411,掀起了利用RNAi技术进行害虫防治研究新的热潮。但是,目前RNAi在害虫防治中的应用还存在一些问题,例如有效靶标基因筛选和应用策略,鳞翅目昆虫对RNAi的敏感性以及双链RNA在环境中的稳定性等等。本文系统总结了RNA干扰现象发现20年来,该技术在害虫防治领域的研究及应用概况,并对RNAi技术应用的可行性、应用方法、存在问题和目前的一些解决办法进行了比较详细的综述。通过对近期研究结果的综合分析发现,dsRNA进入某些鳞翅目昆虫中肠或血淋巴后,被相关核酸酶降解可能是其RNAi效率较低的首要原因。通过对dsRNA进行脂质体修饰,纳米粒子包埋可以在一定程度上解决dsRNA降解的问题,进而提高RNAi效率。     

昆虫的RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是一种强有力的分子生物学技术, 在昆虫研究中得到了较多的应用。目前, RNAi技术主要应用于昆虫功能基因和功能基因组研究, 已在多个目的19种昆虫上实现了RNAi。在昆虫上实现RNAi的方法主要有注射、浸泡、喂食、转基因和病毒介导等方法, 这些方法各有特点, 其中喂食法因其简单而最有应用前景。昆虫RNAi的系统性较为复杂, 只有部分昆虫具有RNAi的系统性。昆虫中RNAi信号传导的基因可能是sid-1, 但昆虫RNAi的系统性机理还不是很清楚。转基因植物产生的dsRNA实现了对作物的保护, 证实了RNAi技术可用于害虫控制, 为害虫控制开辟了新领域。昆虫的RNAi研究处在起步阶段, 研究昆虫RNAi的机理, 特别是RNAi在昆虫体内的系统性扩散机理, 改进实现RNAi的方法, 提高RNAi技术在昆虫研究中的应用, 有利于昆虫基因功能鉴定和害虫控制, 促进昆虫学科的发展。     

RNAi技术在昆虫功能基因研究中的应用进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指外源或内源的双链RNA（dsRNA）特异性地引起基因表达沉默的现象,它作为一种有效的工具用来产生转录后沉默,从而抑制特定基因的表达,成为基因功能研究的一种新方法,除了在模式昆虫如果蝇Drosophila中广泛应用之外,也在非模式昆虫中得到成功应用。近年来,RNAi技术在导入方法和基因功能分析方面都取得了飞速发展,且与转基因技术相结合成功应用于害虫防治领域。本文综述了RNAi技术在导入方法、昆虫功能基因组功能分析及害虫防治等领域新近的研究成果,并展望了该技术的应用前景。     

植物介导的害虫RNA干扰

摘要: 应用植物介导的昆虫RNAi进行害虫防治近10年来受到了广泛的关注,其作用机理包括两个阶段,首先是害虫靶标基因dsRNA在植物体内的表达、运输和贮存,然后是害虫取食该植物后,dsRNA特异性抑制害虫体内靶标基因的表达。目前,植物介导的昆虫RNAi主要针对鳞翅目、鞘翅目和同翅目害虫,可以引起害虫生长发育的异常,导致死亡/繁殖力下降,甚至影响到其子代的生长。影响植物介导昆虫RNAi效率的因素主要包括害虫靶标基因的选择、dsRNA靶定位点及长度、植物表达dsRNA载体的结构和转基因植物的遗传转化方式等。植物介导昆虫RNAi防治害虫的策略也面临着潜在的安全性问题,如转基因植物安全性和RNAi潜在脱靶性等。随着植物介导昆虫RNAi技术的成熟,该方法有望成为害虫防治的新策略。     

RNA干扰技术在昆虫学领域研究进展

RNA干扰(RNAi)是生物体内源基因发生转录后特异性降解的一种生理现象,广泛存在于生物体内。RNAi主要由小干扰RNA诱发阻碍目的基因的翻译或转录,造成目标信使RNA沉默。RNAi具有高效、特异性强等优点,被广泛应用于昆虫基因功能研究,并显示出了开发新型病虫害管理策略的巨大潜力。主要阐述了RNAi的沉默机制,双链RNA转入昆虫体内的几种方式,以及RNAi技术在不同目昆虫中研究的最新进展。最后,对RNAi技术存在的不足之处进行了简单总结,还对RNAi技术在害虫防治中的应用进行了展望,以期为该技术广泛应用于农业害虫防治提供理论支持。     

利用RNAi技术沉默小菜蛾类钙粘蛋白基因

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种调控基因表达的方法, 其通过体外合成一段与内源靶基因同源的双链RNA（dsRNA）或siRNA, 导入生物体内, 使内源靶基因中同源mRNA降解, 从而达到阻抑基因表达的目的。类钙粘蛋白（cadherin-like protein）是位于昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles, BBMV)上与钙粘蛋白(cadherin)结构相似的物质, 是多种昆虫体内Bt杀虫蛋白的受体。本研究利用基因特异引物通过RT-PCR扩增了小菜蛾类钙粘蛋白基因的2个片段（CAD1和CAD2）, 合成相对应的双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）; 并将dsRNA通过显微注射导入小菜蛾3龄幼虫体内, 测定了不同靶位点、不同剂量、不同检测时间对目的基因mRNA表达量的影响。结果表明: 将70 nL CAD1对应的dsRNA注射到幼虫体内48 h后, 基因表达量显著下降, 72 h后恢复。免疫印迹检测结果表明, 类钙粘蛋白在注射dsRNA 48 h后幼虫BBMV中的含量明显下降。本实验成功实现了小菜蛾类钙粘蛋白基因的沉默, 该体系的成功建立为利用RNAi技术分析小菜蛾及其他鳞翅目昆虫基因的功能提供了参考。     

RNAi递送系统在害虫防治中的研究进展

RNAi是由dsRNA引发的,靶向目的 基因的高效与特异的基因沉默技术.由于其高效性、特异性和便捷性,RNAi技术广泛应用于基因功能研究、高通量目的 基因筛选、基因治疗、药物靶标预测和农业病虫害防治等领域.考虑到RNAi效率、安全性和预期靶基因下调的潜在障碍,RNAi提供高效防治应用的前提是以合适的方式递送效应RNA.本文对近期农业重要性害虫和病媒害虫防治应用中开发的RNAi递送系统进行综述,对这些RNAi递送系统的干扰效率和多重进入位点作了比较,并展望了RNAi递送系统在害虫防治中的应用,以期更好地完善RNAi技术在昆虫学研究和害虫防治中的应用.     

RNAi技术在蜂学研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异性引起基因表达沉默的现象,特异性和高效性是RNAi技术的特点。本文主要从调控目标基因的表达、级型分化的分子基础、防治蜜蜂病毒病3个方面概述了RNAi技术在蜂学研究中的应用进展情况,并展望RNAi技术在蜜蜂功能基因组研究领域的应用前景。     

RNAi技术的最新研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发同源mRNA降解,使靶基因沉默的现象。目前,RNAi技术作为基因调控的有效工具,具有高度特异性、高效、可传播等特点,被广泛用于病虫害防治、肿瘤及癌症治疗等领域。尤其在医学上的应用,相对于传统的疫苗预防和药物治疗而言,RNAi技术在靶点用药、减少副作用、抑制致病基因表达等方面具有不可比拟的优越性,在癌症等疾病治疗的新方法中发挥越来越重要的作用。主要介绍RNAi的作用机理、导入方法及其在植物改良、生物防治、昆虫抗药性、疾病的预防与治疗中的最新应用进展,并对其应用前景进行综合分析与评价,以期为相关领域的研究者提供参考。     

二化螟碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶基因RNA干扰技术体系的优化

【目的】比较不同方法以及不同靶标基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)效率,建立并优化二化螟Chilo suppressalis碱性神经酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase基因的RNAi的技术体系。【方法】通过培养液浸泡法将果蝇Drosophila daCER基因的dsRNA导入果蝇S2细胞内;分别通过显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法将体外合成的二化螟saCER和snSMase基因的特异性双链RNA(dsRNA)导入二化螟3龄(注射法)和2龄(喂食法)幼虫体内,之后利用qPCR测定靶标基因的mRNA表达水平,比较不同方法对不同基因的RNA干扰效率。【结果】将果蝇S2细胞浸泡在浓度为15 ng/μL的含daCER dsRNA细胞培养液中培养72 h后,daCER基因的表达水平下降了约84%。dsRNA (5 000 ng/μL)注射二化螟3龄幼虫60 h后对saCER基因的干扰效率达到最高(41%),dsRNA (2 500 ng/μL)注射48 h后对snSMase基因的干扰效率最高(47%);给二化螟2龄幼虫喂食dsRNA(48μg/d)后,分别在第7天和第8天对saCER(32%)和snSMase(52%)基因达到最大干扰效率。对于aCER基因,果蝇S2细胞浸泡法与二化螟注射法和喂食法相比,干扰效率差异极其显著;使用相同方法,对saCER基因和snSMase基因的干扰效率无显著差异;对于二化螟的同一基因(saCER或者snSMase),注射法与荧光纳米粒子喂食法之间干扰效率也无显著性差异。【结论】碱性神经酰胺酶基因和中性鞘磷脂酶基因对导入dsRNA进行RNAi的方法较敏感,本研究建立并优化的显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法RNAi技术体系在鞘脂质代谢酶基因功能的基础研究中具有可行性。注射法和喂食法对二化螟幼虫aCER基因的干扰效率远低于浸泡法对果蝇S2细胞中这一基因的干扰效率,进一步证实二化螟血淋巴中的RNA酶对dsRNA的快速降解以及中肠围食膜的阻隔很大程度上削减了dsRNA进入二化螟细胞内发挥干扰作用。     

显微注射构建烟粉虱的RNAi技术体系

RNAi已经成为揭示基因功能的一个常用的有力工具。在昆虫RNAi技术体系中,通过显微注射方法向昆虫体内注入dsRNA,实现系统性干扰,是最为广泛采用的方法。但对于体型较小的昆虫,注射法操作存在较大的难度,特别是非常微小的昆虫烟粉虱Bemisia tabaci。为了进行烟粉虱大规模基因功能验证,需要开发一套成熟的RNAi技术体系。本研究以烟粉虱的CYP6CM1基因为目标基因,通过显微注射法注射不同浓度的dsRNA到烟粉虱4龄若虫,荧光定量PCR检测其沉默效果。结果表明:在对单头烟粉虱注射50 n L时,注射不同浓度的dsRNA,对CYP6CM1基因的沉默效果不同,最大沉默效率可达到80%以上。因此,本实验成功构建了烟粉虱的RNAi技术体系,也可用于其它粉虱类害虫的RNAi技术。     

利用细菌表达dsRNA介导黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是研究基因功能的一种重要工具。为了利用RNAi技术对黄粉虫抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)基因的非抗冻功能进行验证,将黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433的相应干扰片段构建至L4440干扰载体并转化大肠杆菌HT115(DE3)菌株,利用IPTG诱导表达特异的afp基因相应dsRNA,纯化后注射黄粉虫幼虫,通过实时荧光定量PCR检测afp基因在mRNA水平的变化。结果显示含有L4440-Tmafp重组质粒的HT115菌株可以表达干扰afp基因的dsRNA,命名为Tmafp-dsRNA。用Tmafp-dsRNA注射黄粉虫24 h后,Tmafps的表达受到显著抑制,相比对照下降了60.8%。本研究表明通过注射dsRNA可有效抑制黄粉虫afp基因的表达。     

昆虫RNAi效率的影响因素研究进展

RNA干扰(RNAi)是一种在动植物中广泛存在的、由双链RNA诱发的、导致mRNA特异性沉默的过程.简单总结昆虫RNAi的研究现状,从理论和实践两个方面重点介绍昆虫RNAi效率影响因素的研究进展,最后对昆虫RNAi应用于害虫防治的前景进行展望.     

转录后基因沉默(PTGS)及其在作物遗传改良中的应用

转录后基因沉默(PTGS)或RNA干扰(RNAi)技术的发展为创造植物遗传变异体提供了新途径。PTGS于1998年被明确为双链RNA(dsRNA)诱导的序列特异性基因沉默,短短几年内有关研究取得了突破性进展。结合利用PTGS技术进行的淀粉合成关键酶基因沉默研究,概述了PTGS的作用机理和特点、dsRNA表达载体设计、沉默效应的遗传稳定性及在作物改良应用方面的研究进展。研究表明,基因沉默效应可在子代间稳定遗传并可通过杂交进行重组,显示了其在农作物改良方面的应用潜力。     

昆虫RNAi通路及其核心元件的研究综述

RNAi作为分子生物学的一种重要技术,在昆虫基因功能和功能基因组研究中得到广泛应用,同时,有关昆虫RNAi的机制也受到了大家的关注。近年来的研究结果表明,昆虫RNAi的通路与其他动物相同,根据引起基因沉默的RNA分子的类型,可以分为siRNA、miRNA和piRNA 3种不同的通路。昆虫RNAi通路中的核心元件包括了:(1)行使切割作用的RNaseⅢ家族成员Drosha和Dicer;(2)用来降解目的 mRNA的Argonaute蛋白;(3)dsRNA结合蛋白Pasha、R2D2和Loquacious。了解昆虫RNAi的通路及其核心元件,有助于我们更好地理解昆虫RNAi的分子机制和改进实现RNAi的方法,对促进昆虫RNAi技术的研究及其在害虫防控中的应用具有指导意义。     

系统RNA干扰及在昆虫中的应用

系统性是RNA干扰(RNA interference,RNAi)在植物和线虫中的一个重要特性,即RNAi沉默信号可以在细胞和组织间进行传递,近年来研究发现某些昆虫中也存在系统RNAi现象.RNAi技术对很多领域的发展具有重要的促进作用,包括功能基因组学和害虫防治等领域.综述线虫,昆虫的系统性RNAi研究概况以及RNAi在昆虫领域的应用现状,并展望其应用前景.     

RNA干扰:脑学习和记忆的可能机制

dsRNA介导同源靶基因沉默的RNA干扰 (RNAi)是转录后基因水平沉默的主要作用方式 ,具有普遍的生物学意义。RNAi是dsRNA介导的核酸酶作用于dsRNA(>2 6nt)同源不成熟mR NA的酶解过程 ,mRNA降解为 2 1 2 3nt的dsRNA而使基因表达沉默。RNAi所具有的特性和脑学习和记忆的特征 ,提示RNAi可能是RNA介导的脑记忆移转的潜在机制     

RNAi技术及其在植物研究中的应用

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA,从而特异性地阻断相应基因地表达,且此现象广泛存在于从真菌到植物、无脊椎动物、哺乳动物的各种生物中。介绍了RNA干扰的研究历史、RNA干扰的作用机制及此技术在植物中的应用。     

RNA干扰与基因敲除

RNAi是指通过双链RNA介导特异性降解靶mRNA,导致转录后水平基因沉默的现象。其作用途径有RdRP依赖的RNAi的途径与非RdRP依赖的RNAi途径2种。利用RNAi的基因敲除技术在dsRNA序列选择、质粒或病毒为载体的dsRNA体内合成、发夹样siRNA的转录、dsRNA的导入方法等方面取得了很大进展,在研究人类或其他生物基因组中未知基因及蛋白质的功能等领域具有诱人的应用前景。