滑液支原体醛缩酶的亚细胞定位及免疫原性

【背景】滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染能够引起鸡和火鸡的气囊炎、关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎等。有研究表明,许多支原体中与代谢相关的酶类不仅分布在细胞质,也分布于细胞膜表面,通过结合宿主细胞的胞外基质蛋白,协助病原菌黏附入侵宿主细胞。已有报道牛支原体(Mycoplasma bovis)和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase,FBA)分布在膜蛋白和胞浆蛋白中,而MS的FBA蛋白还未见相关研究。【目的】对MSFBA蛋白进行生物信息学分析、原核表达、免疫原性分析及亚细胞定位检测,为进一步探索MS代谢相关酶类的生物学功能奠定基础。【方法】通过分析软件PSORTb、SignalP 4.1 Server和TMHMM Server在线预测MSFBA的亚细胞定位、信号肽及跨膜区,并用BLASTn和MEGA 5.0进行同源比对及进化树分析;通过Overlap PCR点突变扩增MS的fba全基因序列,连接表达载体pET-28a(+)并进行原核表达及纯化,获得纯化后的重组MSFBA(rMSFBA)蛋白;用MS阳性血清进行Westernblot鉴定rMSFBA的免疫原性;用纯化的rMSFBA蛋白制备兔多克隆抗体,与MS全菌蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白进行Western blot分析,同时对MS全菌进行悬浮免疫荧光分析,检测MSFBA的膜定位情况。【结果】生物信息分析预测MSFBA分布在细胞质中,无信号肽,无跨膜区,在MS种内相似性高达99%,与其他种属FBA相似性在61%-78%之间,进化树显示其与牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、仓鼠支原体(Mycoplasm acricetuli)等的FBA蛋白进化关系较近,与精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominis)等的FBA蛋白进化关系较远;表达rMSFBA蛋白并纯化,经测定其相对分子质量大小约为33kD;rMSFBA能与MS阳性鸡血清特异性结合,证实其具有较好的免疫原性;Western blot显示抗rMSFBA的兔血清能与MS全菌蛋白和胞浆蛋白反应,而与膜蛋白不反应,说明MSFBA蛋白分布于胞浆中;悬浮免疫荧光实验证实MS的细胞膜上未见FBA蛋白分布。【结论】首次报道了滑液支原体的FBA蛋白是一个高度保守的免疫原性蛋白,主要分布在细胞质中,该结果为进一步研究MSFBA蛋白的生物学功能提供了分子基础。     

原玻璃蝇节杆菌D-氨基酸氧化酶及突变体的酶学特性

【目的】研究原玻璃蝇节杆菌(DSM 20168)中D-氨基酸氧化酶的酶学特性。【方法】通过PCR从原玻璃蝇节杆菌(DSM 15035,20168)中克隆获得D-氨基酸氧化酶基因apdaao-1和apdaao-2,构建原核表达载体,以表达质粒pET-ApDAAO-2为模板,采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis技术构建定点突变体,经过原核表达及纯化获得重组型和突变体酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了2个重组蛋白和4个突变体酶蛋白,SDS-PAGE检测显示其分子量均约为36 kDa;酶学特性分析表明,ApDAAO-2和突变体蛋白的最适反应温度为30℃;ApDAAO-2和T286A的最适反应pH范围为7.0-11.0,其它突变体为8.0-11.0;ApDAAO-2和突变体都具有较广泛的底物特异性,除T256K的最适底物为D-Phe外,其余均为D-Met;动力学参数测定结果显示,以二级表观常数kcat/Km表示,对于底物D-Met或D-Phe,ApDAAO-2和4个突变体的kcat/Km值均比ApDAAO-1和pKDAAO高数倍以上。【结论】ApDAAO-2及突变体具有比ApDAAO-1和pKDAAO更广泛的底物特异性和较高的催化效率,有一定的商业应用价值。     

假坚强芽胞杆菌中乙醇降解相关酶的克隆、表达及酶学特性

【目的】研究假坚强芽胞杆菌OF4中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶学特性。【方法】通过引物设计,采用PCR技术从嗜碱芽胞杆菌OF4的基因组DNA中扩增获得乙醇脱氢酶(adh)基因和乙醛脱氢酶(aldh)基因,构建表达载体,通过异源原核表达,Ni-NTA柱层析纯化酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】乙醛脱氢酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为8.0,酶蛋白的活力为979.6 U/mg,其稳定性在25℃和35℃下比45℃稍好;尽管由于乙醇脱氢酶的表达量低而未能纯化获得酶蛋白,但通过双基因共表达及乙醇耐受性实验发现乙醇脱氢酶也具备较高的催化活性。【结论】成功地从假坚强芽胞杆菌OF4中克隆获得了乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因,二者共同作用能够较大提高宿主对乙醇的耐受性。     

苹果树腐烂病菌胞外果胶酶分离纯化及其性质

【目的】分离纯化苹果树腐烂病菌的果胶酶,明确其酶学性质。【方法】利用0.5%淀粉MS培养基对苹果树腐烂病菌分别进行不同天数发酵,DNS法定量测定果胶酶活性。通过硫酸铵梯度盐析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析和阴离子交换层析DEAE-Sepharose Fast Flow分离纯化果胶酶,经SDS-PAGE检测样品纯度,并利用生物化学技术分析其酶学性质。【结果】发酵10 d的发酵液中果胶酶活性最高;分离得到的果胶酶为鼠李糖半乳糖醛酸酶,分子量为58.83 k D,等电点为6.03,最适反应温度为40°C,最适反应pH为3.5,在pH 2.0-5.5之间酶活性比较稳定。Ca~(2+)、Li~+、Co~(2+)对酶活力有激活作用,K~+、Fe~(2+)、Pb~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ni+对酶活有抑制作用,Ba~(2+)和Mg~(2+)对酶活性有钝化作用。酶动力学常数Km和Vm值分别是3.600 g/L和0.162 7 g/(L·min)。【结论】从苹果树腐烂病菌的发酵液中分离得到鼠李糖半乳糖醛酸酶并明确了其酶学性质,为果胶酶抗体的制备和细胞化学研究奠定基础。     

Gluconobacter oxydans木糖醇脱氢酶基因的克隆表达及木糖醇的转化分析

从氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的基因组DNA上扩增出木糖醇脱氢酶基因xdh,构建了诱导型表达载体pSE-xdh,导入E.coli JM109后获得了高效表达木糖醇脱氢酶基因的重组菌JM109/pSE-xdh。通过HisTrap HP亲和层析和SephacrylS 300分子筛两步纯化从细胞中得到纯酶,并对酶学性质进行研究。XDH最适还原反应的pH值为5.0,最适还原反应的温度为35℃;最适氧化反应的pH值为11.0,最适氧化反应的温度为30℃。重组菌中的XDH依赖NADH,对NADH的米氏常数Km=57.8 mmol/L,最大反应速率Vmax=1209.1 mmol/(ml·min)。重组菌的XDH酶活力为13.9 U/mg。利用重组菌和原始菌混合静止细胞转化D 木酮糖,16 h 28.0 g/L D木酮糖生成16.7 g/L木糖醇,而原始菌单独转化只生成8.3 g/L木糖醇。     

以类弹性蛋白多肽为标签的表达质粒构建及其用于木聚糖酶的非色谱纯化

【目的】旨在构建一个能以非色谱纯化目标蛋白的表达质粒,使用自行设计的类弹性蛋白多肽(ELPs)作为非色谱纯化标签,以纯化目标蛋白。该ELPs长度短,对盐非常敏感。【方法】从头设计了木聚糖酶,将其通过一段无规则卷曲同ELPs相连,合成了编码上述序列的基因,并构建重组表达载体pET-22b-SoxB-M2-S-ELP,转化至大肠杆菌BLR(DE3)中诱导表达,采用可逆相变循环经高速离心纯化木聚糖酶,并考察纯酶的酶学性质。【结果】成功构建了表达载体并表达,在pH=7.0时0.5 mol/L碳酸钠可使ELPs的相变温度降至22℃。在上述条件下,对木聚糖酶进行了非色谱纯化,其纯化倍数为3.2,回收率为21.2%,纯度为64.3%。经测定,未连接ELPs的酶、粗酶及纯化酶学性质基本一致,其最适温度为60℃,最适pH为6.0,最适反应时间为30 min,粗酶70℃保温1 h相对酶活仍有50%,为嗜热木聚糖酶,与预期相符。【结论】ELPs作为非色谱纯化标签纯化重组木聚糖酶具有操作简单、易于放大、成本较低的优势,故所构建的重组质粒可望通用于分离多种重组蛋白,具有较广泛的用途。     

一种海洋琼胶酶的分离纯化、酶学性质研究及降解产物分析

摘要：【目的】对海洋Agarivorans albus QM38菌株所产琼胶酶的纯化工艺和酶学性质进行了研究。【方法】发酵液通过离心、(NH4 ) 2SO4盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析、Sephacry S-100 凝胶过滤等纯化步骤得到SDS-PAGE电泳级纯酶,并用质谱对酶的降解产物进行分析。【结果】得到琼胶酶A,纯化倍数为17.6倍,收率为15.21 %,SDS-PAGE测定其分子量为127.8 kDa。对琼胶酶A进行了进一步的性质分析,其最适反应温度为35 ℃,最适反应pH为7.6,最适底物浓度为0.9 %,多数金属离子为其活性抑制剂。琼胶酶A的降解产物经质谱分析主要为四糖和六糖。【结论】从菌株QM38的发酵液中纯化得到的琼胶酶A具有降解凝胶态琼胶的能力,其分子量与以往报道过的琼胶酶不同。     

链霉菌M-Z18膜蛋白ε-聚赖氨酸降解酶的分离纯化、酶学性质及应用

【目的】研究链霉菌Streptomyces sp.M-Z18ε-聚赖氨酸降解酶(Pld)的分离纯化及其生理生化特性,并利用该酶制备低聚合度ε-聚赖氨酸(ε-PL)。【方法】菌体细胞经超声破碎、NaSCN溶解和HiTrapTMButyl HP疏水层析制备到Pld,随后研究了其酶学性质、动力学和降解ε-PL过程,最后利用常量稀释法比较了不同聚合度范围ε-PL的最小抑菌浓度。【结果】从Streptomyces sp.M-Z18细胞膜上分离纯化到Pld,纯化倍数为80.4倍,回收率达到59.3%。以L-赖氨酰对硝基苯胺为底物,酶促反应的最适温度为37℃,最适pH为7.0,动力学常数Km为0.621 mmol/L,Vmax为701.16 nmol/min·mg;酶活在pH 7.0-10.0和50℃以下稳定。降解ε-PL实验发现,纯化到的Pld以内切方式降解ε-PL。抑菌实验表明,高聚合度ε-PL(30-35)对细菌的抑制效果较好,而低聚合度ε-PL(8-20)更有利于抑制酵母菌的生长,各种聚合度ε-PL对霉菌的生长抑制均较差。【结论】从ε-PL产生菌中分离纯化到内切型ε-PL降解酶,发现不同聚合度范围ε-PL对微生物的抑制能力存在显著差异。     

双功能域β-折叠桶碱性植酸酶蛋白序列分析与酶学特性

【目的】表达、纯化来源于Bacillus sp.HJB17的双功能域β-折叠桶碱性植酸酶(phy HT),并对该酶进行蛋白序列以及酶学特征分析,为该酶的广泛应用奠定基础。【方法】应用生物信息学技术,对phy HT蛋白序列进行了生物信息学分析。表达、变复性、分离纯化得到具有酶活性的可溶性phy HT蛋白溶液,通过硫酸亚铁-钼蓝法对phy HT的酶学特性进行了研究。【结果】序列分析结果显示,phy HT由633个氨基酸组成,含有2个植酸酶结构域,属于典型的BPP植酸酶,相对分子量(MW)为69321.68 Da,理论等电点为5.37,为亲水性蛋白。二级结构中,phy HT中α-螺旋(helix)、β-片层(sheet)占主要的比例,高级结构以β片层形成的桶状结构为主。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为35°C,在45°C以下比较稳定。最适的p H为8.0,在p H为6.0–12.0条件之间比较稳定。低浓度的Ca~(2+)以及Mg~(2+)对酶活性有促进作用,Fe~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(2+)等金属离子对酶活性有抑制作用。【结论】本研究成功对phy HT进行了蛋白序列分析以及酶学性质研究,phy HT属于碱性植酸酶,酶活性高、稳定性好,在理论研究和工业生产方面均有很大应用价值。     

腾冲嗜热厌氧菌丙氨酸消旋酶底物通道氨基酸位点的功能

【目的】通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能。【方法】利用定点突变PCR技术构建突变体,通过亲和层析法纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性及其稳定性。【结果】通过定点突变PCR成功得到8个突变体,酶学特性分析发现,A172位点突变为丝氨酸(S)后酶蛋白的相对活性有所提升,但含有该位点突变的酶蛋白稳定性均大幅下降;S173位点突变为天门冬氨酸(D)后导致突变体蛋白的最适反应温度提升了15°C,半衰期大幅延长,但相对活性明显下降。【结论】丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内A172和S173位点均是影响酶蛋白催化活性和稳定性的关键位点。     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Comparative morphology of the carpel in the Liliaceae: Hewardieae, Petrosavieae, and Tricyrteae

The young pistils in the melanthioid tribes, Hewardieae, Petrosavieae and Tricyrteae, are uniformly tricarpellate and syncarpous. They lack raphide idioblasts. All are multiovulate, with bitegmic ovules. The Petrosavieae are marked by the presence of septal glands and incomplete syncarpy. Tepals and stamens adhere to the ovary in the Hewardieae and the Petrosavieae but not in the Tricyrteae. Two vascular bundles occur in the stamens of the Hewartlieae and Tricyrtis latifolia. Ventral bundles in the upper part of the ovary of the Hewardieae are continuous with compound septal bundles and placental bundles in the lower part. Putative ventral bundles occur in the alternate position in the Tricyrteae and putative placental bundles in the opposite. position in the Petrosavieae. The dichtomously branched stigma in each carpel of the Tricyrteae is supplied by a bifurcated dorsal bundle.     

Entwicklungsgeschichte und Ultrastruktur von Pollenkitt und Exine bei nahe verwandten entomophilen und anemophilen Angiospermensippen derAlismataceae,Liliaceae, Juncaceae,Cyperaceae, Poaceae undAraceae

Some closely related members of the monocotyledonous familiesAlismataceae, Liliaceae, Juncaceae, Cyperaceae, Poaceae andAraceae with variable modes of pollination (insect- and wind-pollination) were studied in relation to the ultrastructure of pollenkitt and exine (amount, consistency and distribution of pollenkitt on the surface of pollen grains). The character syndromes of pollen cementing in entomophilous, anemophilous and intermediate (ambophilous or amphiphilous) monocotyledons are the same in principal as in dicotyledons. Comparing present with former results one can summarize: 1) The pollenkitt is always produced in the same manner by the anther tapetum in all angiosperm sub-classes. 2) The variable stickiness of entomophilous and anemophilous pollen always depends on the particular distribution and consistency of the pollenkitt, but not its amount on the pollen surface. 3) The mostly dry and powdery pollen of anemophilous plants always contains a variable amount of inactive pollenkitt in its exine cavities. 4) A step-by step change of the pollen cementing syndrome can be observed from entomophily towards anemophily. 5) From the omnipresence of pollenkitt in all wind-pollinated angiosperms studied one can conclude that the ancestors of anemophilous angiosperms probably have been zoophilous (i.e. entomophilous) throughout.

     

Identification and Characterization of the First Equine Parainfluenza Virus 5

正Dear Editor,Parainfluenza virus 5 (PIV5), known as canine parainfluenza virus in the veterinary field, is a negative-sense,nonsegmented, single-stranded RNA virus belonging to the Paramyxoviridae family (Chen 2018). The virus was first reported in primary monkey kidney cells in 1954 (Hsiung1972), then it has been frequently discovered in various