固氮螺菌氢代谢与固氮作用的关系I.固氮螺菌放氢现象与吸氢能力的研究

本文研究了固氮螺菌(Azosptrillum brastlense)的放氢现象和吸氢酶活性以及与固氮作用的关系。测定了57株固氮螺菌的放氢现象及其固氮酶活性,其中不放氢41株,微放氢14株,其放氢量为2·63—31.00n mol C2H4／ml菌液·小时。放氢量较多的2株R38{和R256A都是从水稻根表上分离获得,其放氢量分别为185.75n mol H2／ml 菌液·小时和547．00 moIH2／ml 菌液·小时。测定了53株螺菌的吸氢酶活性,它们均具有吸氢能力,其吸氢量各异,0-63-27·38n mol H2／ml菌液。小时。生长在含有NH4CI培养基上的固氮螺菌既没有固氮能力,也不产氢。在无氮培养基上所产生的氢是固氮过程中放出的氢。实验结果指出,C2H2抑制氢酶的活性。当吸氢的菌株与放氢菌株混合培养时,其固氮酶活性比单株纯培养高,有氢存在时,固氮酶活性比不加氢时高。     

紫云英根瘤菌及巴西固氮螺菌的氢酶表达特征

紫云英根瘤菌氢酶表达依赖于H_2并受碳底物和高O_2浓度的阻遏及cAMP的显著促进。整体细胞的吸氢活性对O_2不敏感,受碘乙酸(50mmol L~(-1))的强烈抑制。少数氧化还原电位为正值的人工电子受体可支持吸氢活性。与紫云英根瘤菌不同,巴西固氮螺菌氢酶表达并不依赖于H_2,受碳底物阻遏及cAMP促进的效应均不显著,而对O_2敏感。整体细胞吸氢活性受碘乙酸的抑制作用不明显。无论正、负值氧化还原电位人工电子受体均可支持吸氢活性。在经饥饿的静止细胞中,H_2可支持固氮活性并增强固氮酶对O_2的耐受能力。     

巴西固氮螺菌中吸氢酶基因同源性的分子检测

通过TTC(2 ,3,5 氯化三苯基氮唑 )实验筛选出 12株能产生吸氢酶蛋白 (Hup+ )的巴西固氮螺菌 (Azospir rilumbrasilense)菌株。用Qiagen柱分离提纯含豌豆根瘤菌的hup基因片段的质粒 pHVT10 9和pHVT115 ,并用地高辛标记法标记pHVT115 ,与 12株Hup+ 巴西固氮螺菌的总DNA进行斑点杂交 ,结果显示pHVT115所含的吸氢酶基因 (hup基因 )片段与巴西固氮螺菌的大部分菌株的hup基因同源性不强。这一结果表明hup基因在固氮生物中存在着遗传多样性 ,异源hup基因探针不一定都适宜于探测hup基因。     

固氮螺菌氢代谢与固氮作用的关系III．转座子Tn5诱变的 Azospirillum brasilense 吸氢活性缺陷株的筛选

以携带有自杀性质粒pR64：：Tn5的大肠杆菌(E．Coil RL29)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌W251-10(Azospirillura brasilense W251-10)进行杂交,在选择性平板上测得卡那霉素抗性菌落与受体菌菌落之比为5．0x 10-7。受体菌W251-10的卡那霉素抗性自发突变频率小于1.14×10-9。经气相色谱仪分析测得一株丧失吸氢酶(Hydrogen Uptake Hydrogenase)活性的突变株(编号为 Azospin llum brasilense WG15),同时发现其固氮酶(Nitrogenase)话性也已丧失。 DNA分子点杂交结果表明,所获得的突变株WGl5的总DNA中存在有’n5的序列,而w251—10呈阴性结果,从而证实了WGl5吸氢活性的丧失是由于Tn5在DNA中的插入引起的,同时也揭示了巴西固氯螺菌的吸氢酶基因(缸p)和固氮基因(nr,) 在遗传学上有着连锁的关系。     

固氮鱼腥藻(Anabaena azotica Ley HB686)的固氮和放氢作用

固氮鱼腥藻(水生686)整体水平在光照下同时有释氢和放氧的现象。氢的释放量与乙炔还原活性有平行的关系。在暗期,释氢量极少。 固氮鱼腥藻在光照下具有较强的吸氢作用,这是由于氢酶有吸氢的特性。我们看到H_2和O_2的浓度对氢酶的活性有一定的影响。氢酶催化分子氢和分子氧的反应的Km值分别为1.6mM和0.5mM。 分子氢能明显地支持乙炔还原作用,当以空气为气相的反应体系中含有10％分子氢时,大大地提高乙炔还原的活性。 铵离子不仅抑制乙炔还原,而且对释氢作用也有明显的抑制。随着铵离子浓度的增加抑制作用愈为显著。当铵离子浓度达到10mM时,乙炔还原和释氢都几乎全被抑制。说明放氢与固氮酶的活性有密切的联系。 DCMU(2×10~(-5)M)对乙炔还原活性和释氢的抑制约20％,DNP(5×10~(-4)M)表现出更强烈的抑制。     

固氮螺菌CWV-22突变株与玉米、小麦联合体的固氮作用

应用乙炔还原法和同位素15N示踪技术证明固氮螺菌CWV-22是具有耐高铵、泌铵能力的突变株。它在含有50mM NH+4浓度的纯培养固氮试验中,吸收”N量为135μg／mg蛋白,不接种的对照吸收“N量为零,接种Sp7的只有1／~g]mg蛋白,在测试允许误差之内,证明Sp7的固氮作用是不耐铵的。在密闭培育装置中,用15N示踪植物试验：1．种植玉米或小麦,接种不耐铵的。P7或耐铵的CWV一22菌株,不论在有或无NH,Ac的条件下,植物吸收的生物固定”N量均远远高于不接种细菌的对照植物,达4．5—9．0倍;2．接种耐铵CWV一22菌株不受NH(Ac存在的抑制,接种不耐铵sp7菌株则受到显著的抑制,但仍有一定的固氮作用,并将固定的”N输送到植物根、茎、叶里。经检测,在有NH．Ac条件下,根际砂中含nil+量降低到l--2mM(远离根际的砂中含N时为29．1raM),低于对。P7菌株的抑制浓度,可能是。P7仍有固氮活性。     

巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）吸氢酶基因的研究及展望

固氮生物在固氮过程中不可避免地将产生电子的消耗和能量的损失;固氮酶每转化一分子儿为氨需消耗4对电子和16个ATP,同时释放出一分子H2。而吸氢酶对所产生氢气的氧化作用可提供固氮过程中所需的还原力,从而提高了固氮微生物的固氮效率。通过分子生物学的实验手段可进行巴西固氮螺菌吸氢酶基因（hup基因）的定位和分离克隆,并进一步构建含多拷贝hup基因的固氮基因工程菌,为提高固氮效率,增加农作物经济产量提供一种有效的氮素营养供给手段。氛是植物生长发育不可缺少的元素。氮气虽然占空气重量的75．54畅,但植物和大多数微生物都不…     

水稻根际兼性厌氧催娩克氏杆菌和阴沟肠杆菌的固氮与氢代谢

兼性厌氧细菌Enterobacter cloacae菌株E-26和Klebsiella oxytoca菌株NG-13的氢酶与固氮酶同时形成。固氮的最佳碳源为蔗糖、葡萄糖和丙酮酸,此外延胡索酸和苹果酸也能支持固氮。支持固氮的碳源也支持放氢,两者动力学基本一致。40％乙炔预处理后,吸氢活性下跌,放氢量未增加;NH_4~ 抑制固氮酶,但未导致放氢量降低;可能E-26菌株的放氢主要依赖于氢酶。菌株E-26和NG-13的吸氢反应,既能以O_2为电子受体,也能以延胡索酸、硝酸、MB为电子受体。但仅延胡索酸为电子受体时,E-26菌的固氮活性被分子H_2促进,它的氢吸收利用与固氮相偶联;而在CO_2和NH_4~ 代谢与H_2利用之间并无明显相关性,吸氢活性不被CO_2和NH_4~ 促进。     

镍对荚膜红假单胞菌氢酶和固氮酶活性的促进作用

本文报道了过渡金属镍离子对荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)菌株N3氢酶吸氢活性和固氮酶乙炔还原活性的促进作用,当培养基内的镍离子浓度为IμM时,生长菌体的氢酶具有最大的吸氢活性,但镍离子对固氮酶活性的最适浓度为5pjIfo镍离子加入到整体细胞或无细胞提取液中,对氢酶话性无促进作用。镍离子加入到整体细胞中,固氮酶活性也没有被促进。其它一些过渡金属离子,例如Co2+、Cu2+、Zn2+什对氢酶和固氮酶活性均无促进作用。无论有无镍离子存在,螯合试剂。O-phenanthroline 和EDTA 对生长菌体的氢酶和周氮酶的活性均有少量的抑制作用,基于以上试验结果,对Ni2+参与Rps. Capsulata 氢酶蛋白质合成以及有关作用机理进行了讨论。     

肺炎克氏杆菌nifA基因在巴西固氮螺菌固氮基因表达的铵调节中的作用

固氯螺菌(Azospirillum)是一类仅在限铵和微好氧条件下固氮的微生物,它可与许多禾本科作物联合共生⑴,具有较大的应用潜力。铵作为固氮作用的调节信号,在固氮螺菌的实际应用中是首要的限制因素。在固氯螺菌中,铵不但具有与肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)相似的阻遏固氮酶合成的作用,而且还对已合成的固氮酶进行活性调节⑵。研究表明,其固氮酶翻译后活性调节的机制类似于深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)⑶,即在有铵条件下其固氮酶铁蛋白的一个亚基被共价修饰而丧失活性,这一过程是可逆的。由于铵在固氮螺菌中双水平地调节固氮作用,使得在野生菌株中研究其固氮基因表达水平上的调节较为困难。Zhang等⑷利用区域定位诱变技术获得了巴西固氮螺菌Sp7（A．Brasilense Sp7)的draT-突变株,在该突变株中铵不再影响固氮酶的活性,这为其固氮基因表达调节的研究提供了一个良好的材料。本文将组成型表达的肺炎克氏杆菌nifA基围引入该突变株中,通过分析讨论铵对巴西固氮螺菌固氮基固表达的调节作用方式。     

固氮螺菌的固氮分子调控研究进展

本文对巴西固氮螺菌周氨基因的结构和调控进行综述。其固氮基因的调控可分为两种水平：通过DRAT-DRAG系统的翻译后水平和通过NifA蛋白的转录水平。通过NifA活性进行调控的机理目前尚不明了。     

肺炎克氏杆菌的nifA基因产物在巴西固氮螺菌中的功效

通过三亲本杂交将质粒pCK3{携带改变了启动子的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneuma-niae)nifA 基因]引入巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62菌株中,由此获得的转移接合子巴西固氮螺菌Yu62-4菌株在6．0 mmol/L以上NH+4浓度下,能表现出微弱的固氮酶活性(相当于无NH+4时活性的0．3-0．5％),而野生型Yu62则全部丧失固氮酶活性。固氯酶的丙烯酰胺凝胶电泳和铁蛋白的免疫杂交实验表明,转移接合子Yu62-4在高NH+4(50mmol／L)下,虽有铁蛋白合成,但合成量比无NH+4时少得多,而且有一部分铁蛋白未被共价修饰;野生型菌株Yu62在此NH+4浓度下无铁蛋白合成。实验结果表明：外源(来自肺炎克氏杆菌)的基因产物在巴西固氮螺菌Yu62中不能有效地解除NH+4对该菌固氮酶合成的阻遏作用。本文分析了出现这种现象的原因。     

固氮螺菌耐高铵突变株的选育

应用亚硝基脏(N-nitrosoguanidine,NTG)诱变剂对固氮螺菌菌株Ma241、Ma99、Sp7和G14进行诱变处理后,在掭加了铵的类似物乙撑二胺(ethyleae diamina)的D6bcreiner无氯培养基中进行筛选．反复纯化,获得了在4 5 n、M NH}浓度以上,保持固氯酶活性的耐铵突变株共9株。突变株22的耐铵固氮酶活性最强,在75mM NH+4浓度下,固氮酶活性达到464n mol乙烯／mg蛋白·小时,在200m M NH+4浓度下,固氯酶话性仍有32nmol/mg蛋白·小时。     

氢酶与固氮酶在细菌光合固氮中的联系

研究了混养型光合细菌Rhodopseudomonas capsulata N-3 氢酶与固氮酶之间的联系,观察到:1.以苹果酸(30毫克分子)为碳源,谷氨酸(5毫克分子)为氮源,营光合异养生长的菌体由固氮酶催化释放出大量的分子氢,光合放氢的过程完全依赖于光和外加电子供体,NH_4~ 对这一过程有明显抑制作用。2.营光合异养生长的光合细菌具活跃的氢酶,是膜结合态,能以多种生理活性物质,如NADP,反丁烯二酸,硝酸盐,氧及一些氧化还原染料为受体,吸取分子氢,这一过程显著地被NH_4~ 所促进。3.氢酶催化分子氢,支持光合固氮活性,这一固氮活性对氧的酶感性显著下降。4.当有机底物浓度不足时,分子氢所支持的固氮活性更为有效,有机底物浓度处于过量时,分子氢不再支持固氮。5.乙炔对氢酶活性具不可逆的抑止作用,氢酶被抑止后,固氮酶所催化的光合放氢显著剧增。 基于上述结果,对氢酶和固氮酶在细菌光合固氮中相互联系及其对光合细菌光能异养和光能自养两种生长方式间的转换的可能作用进行了讨论。     

大豆—根瘤菌共生固氮氢代谢的研究

检测了四株大豆根瘤菌在不同的大豆品种上形成根瘤的放氢、吸氢、固氮活性及豆血红蛋白的含量;同时测定了植株干物质的积累。结果表明,所有固氮根瘤都放氢,自生条件下Hup~-根瘤菌形成的根瘤仍不具吸氢活性,相对固氮率在0.75左右。而Hup~(?)菌株根瘤的相对固氮率在0.91～1之间。寄主植物对Hup~(?)菌株的吸氢活性有影响。相关分析表明,根瘤的豆血红蛋白与吸氢活性呈负相关。干物质积累与固氮酶活性关系最密切,氢酶活性的影响是次要的。     

巴西固氮螺菌Yu62 nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD－PCR法克隆了巴西固氮螺菌（Azospirillun brasilense)Yu62和nifA基因。序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源（96．5％）,其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97．6％。该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA^-突变株的Nif^-表型。研究了NH4^ 和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响。结果表明：nifA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl4与微氧（0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%-0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性。     

固氮细菌导入水稻原生质体并再生植株

本工作利用广亲和水稻品种02428细胞悬浮系为材料、分离出原生质体,将固氮细菌Alcaligenes faecalis A-1501导入水稻原生质体并分化培养成株。A.faecalis A-1501是我国南方分离出的一种水稻根际固氮细菌,具有较高的固氮酶活性和吸氢酶活性,并可利用同化 CO_2作为碳源生长及进行固氮作用。该菌不仅可附着和积聚在水稻根表,并可进入水稻根细胞以至原生质体内,并具有固氮活性。     

水稻根表固氮螺菌的鉴定

作者从水稻根表分离获得一批固氮细菌,对其中固氮活性较高的菌株R₃₈(固氮活性为429.02n·mol·C₂H₄/ml·hr.)进行形态特征和生理生化等特征的鉴定,确定R₃₈属于巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)     

固氮微生物的氢酶与固氮作用

本世纪三十年代初期,Stevenson和Stickland给细菌中能活化H_2的酶命名为“氢酶”。四十年代初,Wilson等人首次指出棕色固氮菌具有氢酶。五十年代中期Hock发现了豆科植物根瘤放H_2,自生固氮菌在固氮过程中放H_2。十年以后,Dixon指出两株豌豆根瘤菌形成不放H_2的根瘤,其类菌体中含有吸H_2酶(H_2-uptake hydrogenase),吸H_2酶参与固氮酶作用所释放H_2的再循环。从理论上计算,固氮酶每还原一克分子N_2,要消耗35克分子ATP,其中7克分子ATP用于还原质子(H~+)为H_2。这个数字说明固氮微     

固氮螺菌与植物的相互关系研究进展

固氮螺菌与植物的相互关系研究进展阎大来,何路红,李季伦（北京农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京１０００９４）固氮螺菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）首先是从巴西热带禾本科牧草俯仰马唐（Ｄｉｇｉｔａｒｉａｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）根际分离得到的￣［１,２］...