成年大鼠嗅鞘细胞与嗅觉神经成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的 建立一种原代提取嗅鞘细胞与嗅觉神经成纤维细胞混合培养的方法.方法 自2.5月龄SD大鼠嗅球最外两层分离嗅鞘细胞和嗅觉神经成纤维细胞进行混合培养,并不进行纯化,分别于7 d、10 d、14 d行免疫细胞化学鉴定,并计算各个时间点嗅鞘细胞的纯度.结果 体外培养的嗅鞘细胞主要呈两极或多极状,而嗅觉神经成纤维细胞则成扁平的像成纤维细胞的形态,免疫细胞化学结果显示嗅鞘细胞呈p75 NGFR阳性,嗅觉神经成纤维细胞呈fibronectin阳性,两种细胞都呈vimentin阳性,在7 d、10 d、14 d各个时间点嗅鞘细胞分别占混合培养的34.1%、25.6%、8.6%.结论 从成年大鼠嗅球最外两层分离的培养中主要包含嗅鞘细胞和嗅觉神经成纤维细胞,嗅鞘细胞在混合培养中所占的比例随培养时间的延长而逐渐降低.     

成年转基因小鼠嗅鞘细胞的培养、纯化及生物学特性

已有多项研究表明,嗅鞘细胞具有修复中枢及外周神经损伤的潜能。我们选用了表达增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,eGFP)的成年小鼠,分离其双侧嗅球嗅神经纤维层及嗅小球层细胞,体外原代培养并予以纯化。同时结合共聚焦、相差显微镜,细胞增殖分析及免疫组织化学鉴定等技术,对其生物学活性进行研究。结果表明:(1)原代培养转基因成年小鼠嗅球嗅鞘细胞(Olfactoryensheathingcells,OECs)15d后,主要存在两种不同形态和免疫组织化学特征的细胞。一种是带有长突起的双极或多极OECs,表达P75~(NIR)(P75lowaffinityneurotrophicreceptor)S100和胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)。另一种则是对Thy1.1抗体免疫反应阳性,呈扁平或内皮样形态的成纤维细胞。(2)根据不同类型细胞在未覆层的培养器皿上贴壁速度的差异,我们建立了一种简单易行、不需任何抗体或昂贵仪器的细胞纯化方法,获得了大量高纯度的OECs。(3)在连续纯化培养22d后,OECs仍能保持较高的增殖活性。本实验支持和丰富了OECs发育的相关理论,为进一步体内移植修复CNS损伤提供了理想的材料。     

自组装IKVAV多肽纳米纤维支架凝胶及其对嗅鞘细胞的作用

旨在观察自组装IKVAV多肽纳米纤维支架凝胶对鼠嗅鞘细胞(OECs)的作用。通过调整IKVAV溶液pH值并加入培养液触发多肽自组装为支架凝胶, 用原子力显微镜检测IKVAV分子可以自组装成编织状纳米纤维(直径为3~5 nm)。采用原代分离培养方法获得OECs单细胞悬液后, 使用差速贴壁法两次纯化OECs且在第12天通过免疫染色计数OECs纯度为85%。将IKVAV多肽纳米纤维支架凝胶与OECs复合培养, 倒置显微镜下观察OECs生长良好, Calcein-AM/PI活、死细胞染色表明活细胞数达95%。CCK-8法间接细胞计数证实IKVAV多肽可促进OECs的黏附, 对OECs增殖没有影响。由此可见IKVAV多肽可以自组装成纳米纤维支架凝胶且对OECs有良好的生物相容性及黏附作用, 可作为神经组织工程支架材料。     

成年转基因小鼠嗅鞘细胞的培养、纯化及生物学特性

已有多项研究表明,嗅鞘细胞具有修复中枢及外周神经损伤的潜能。我们选用了表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）的成年小鼠,分离其双侧嗅球嗅神经纤维层及嗅小球层细胞,体外原代培养并予以纯化。同时结合共聚焦、相差显微镜,细胞增殖分析及免疫组织化学鉴定等技术,对其生物学活性进行研究。结果表明：（1）原代培养转基因成年小鼠嗅球嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）15d后,主要存在两种不同形态和免疫组织化学特征的细胞。一种是带有长突起的双极或多极OECs,表达P75^NTR（P75 low affinity neurotrophic receptor）、S100和胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）。另一种则是对Thy 1．1抗体免疫反应阳性,呈扁平或内皮样形态的成纤维细胞。（2）根据不同类型细胞在未覆层的培养器皿上贴壁速度的差异,我们建立了一种简单易行、不需任何抗体或昂贵仪器的细胞纯化方法,获得了大量高纯度的OECs。（3）在连续纯化培养22d后,OECs仍能保持较高的增殖活性。本实验支持和丰富了OECs发育的相关理论,为进一步体内移植修复CNS损伤提供了理想的材料。     

嗅鞘细胞的不同纯化方法及结果

培养的嗅鞘细胞的最终纯度受到多种因素的影响,如嗅鞘细胞的取材来源、分离方法等等;对培养的嗅鞘细胞进行纯化可获得高纯度的嗅鞘细胞。纯化嗅鞘细胞的方法有许多种,主要有单纯差速贴壁法、免疫吸附法、化学药物抑制法、无血清饥饿法等,现在的实验研究更趋向于以上2-3种方法联合应用对嗅鞘细胞进行纯化,这些联合纯化方案主要是在采用单纯差速贴壁方法的基础上再次运用其他一种或几种方法进行嗅鞘细胞的纯化。就获取的嗅鞘细胞的最终纯度而言,许多方法取得了可观的效果。但不同的纯化方法各有利弊,除了价格不同外,不同的纯化方法对嗅鞘细胞的生物活性造成不同程度的影响。因此在选择纯化方法时,应综合考虑各方面因素,根据研究目的和实际需要选择合理的方案进行纯化。本文通过查阅各数据库中与嗅鞘细胞的分离培养及纯化有关的文献和其他相关书籍,来探讨纯化嗅鞘细胞的不同方法以及这些纯化方法对嗅鞘细胞最终纯度的影响。     

离体培养嗅鞘细胞促进新生大鼠螺旋神经节细胞的存活

本文旨在探索离体实验中的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)有无促进耳蜗听觉传入神经元——螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)存活作用及其可能机制。取成年大鼠嗅球和新生大鼠蜗轴组织块进行OECs与SGCs的培养,采用差速贴壁法纯化培养OECs。实验分OECs与SGCs共培养组和SGCs单独培养组。倒置相差显微镜下观察OECs和SGCs生长状态,神经营养因子受体p75免疫组织化学法鉴定OECs,神经元特异性标志物βIII-tubulin标记SGCs。为了研究OECs与SGCs共培养体系中,前者促进后者存活的可能机制,共培养组中分别加入脑源性神经生长因子(BDNF,500pg/mL)和BDNF抗体(IgY型,50μg/mL),对照组为未加任何处理的共培养组,然后检查各培养组中SGCs存活数量和存活时间。结果显示,OECs贴壁培养7d后形成一细胞单层,在OECs与SGCs共培养体系中,SGCs在OECs形成的细胞单层的表面生长,并伸出长突起,呈现典型的双极神经元形态;在培养的前6天内,随着培养时间的增加,两组中的SGCs都较接种前减少,但共培养组中SGCs存活数量明显高于SGCs单独培养组(P0.01);单独培养组的SGCs数量在培养的第6天出现大幅度减少,在培养的第9天几乎没有生长;共培养组的SGCs数量未见明显变化(P0.05);共培养中加入BDNF对OECs促进SGCs存活无明显影响,而加入BDNF抗体(IgY)后存活的SGCs减少(P0.01)。本研究结果提示,OECs与SGCs共培养能够促进新生大鼠SGCs存活和突起生长,延长存活时间,OECs分泌BDNF可能是促进SGCs存活的机制之一。     

甘丙肽及其受体在嗅成鞘细胞中的表达及对细胞增殖的影响

本实验从新生大鼠嗅球中分离出嗅成鞘细胞,进行体外培养。运用RT-PCR方法检测甘丙肽及其受体在体外培养的嗅成鞘细胞中的表达;运用MTT法检测甘丙肽及其受体激动剂、拮抗剂对嗅成鞘细胞增殖的影响。结果显示:嗅成鞘细胞表达甘丙肽(GAL)及其受体GalR2,而不表达其他两种受体GalR1和GalR3;甘西肽及两种受体激动剂GAL1-11和GAL2-11能够明显地抑制体外培养的嗅成鞘细胞的增殖,这一效应可被非特异性甘丙肽受体拮抗剂M35所阻断。     

甘丙肽对嗅成鞘细胞三种神经营养因子mRNA表达的影响

实验从新生大鼠嗅球中分离出嗅成鞘细胞,进行体外培养。运用半定量RT—PCR方法检测甘丙肽对体外培养的嗅成鞘细胞中三种神经营养因子（LIF、CNTF和GDNF）mRNA表达的影响。实验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）作为内参照。结果显示：体外培养的嗅成鞘细胞表达此三种神经营养因子的mRNA;当甘丙肽作用于细胞3d后,嗅成鞘细胞中LIF和GDNF表达量明显降低,而CNTF的表达量则没有发生明显变化。     

嗅鞘细胞复合PLGA导管修复周围神经缺损的研究

探讨嗅鞘细胞(OECs)复合聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)导管对大鼠坐骨神经缺损的修复作用。方法:SD大鼠80只,随机分成4组,切除右侧部分神经干造成10mm的神经缺损。OECs PLGA组用充满细胞外基质凝胶和OECs悬液(CM-DiI预标记)的PLGA导管桥接坐骨神经缺损;OECs 硅胶管组用含相同内容物的硅胶管桥接;PLGA组和硅胶管组则分别用充满细胞外基质凝胶和DMEM/F12培养基的PLGA导管和硅胶管桥接。术后每周进行感觉运动功能检测,8周时行腓肠肌湿重恢复率、乙酰胆碱脂酶(AChE)染色、电生理和组织形态学分析等检测,同时移植细胞的两组每周进行细胞示踪观察。结果:移植细胞沿神经纵轴分布;除坐骨神经功能指数(SFI)指标外,OECs PLGA组的各项再生功能指标均优于其它三组。结论:OECs复合PLGA导管能够促进再生神经的成熟和靶组织功能的恢复,二者联合移植是一种有效的周围神经缺损修复方法。     

嗅神经鞘细胞的培养纯化及体外生长特性

采用原代培养的方法,从2,5月成年大鼠的嗅球分离培养嗅神经鞘细胞（OECs),培养6天后,用阿糖胞苷（Ara-C)抑制,差速贴壁,Forskolin和BPE营养物质处理,根据P75蛋白免疫细胞化学染色和形态学特征分析了所得细胞的纯度,同时对不同培养时期的OECs 的形态进行观察和纯化后的活力测定。实验结果显示：（1）这种纯化方法简单,经济,快捷,所得的OECS纯度可达95％以上,并且随培养时间延长,细胞仍保持较高的纯度。（2）在培养早期2天到5天主要以巨噬细胞状,多极状,不规则状为主,培养中期7天到20天主要以扁平的双极,三极为主。晚期20天以后呈现双极,三极形态,其起上有许多细小的棘突。93）其中以培养早中期细胞的活力较好,培养20天以后,细胞活力较差,本研究为以OECs 作为移植材料对促进神经再生的研究获得丰富的细胞来源奠定了基础。