一个与小鼠锌指蛋白基因ZF-12相关的假基因的克隆和鉴定

小鼠类Krüppel锌指蛋白基因ZF-12为人的类Krüppel锌指蛋白基因ZNF191的同源基因,它们都编码368个氨基酸残基,N端存在SCAN结构域,C端有4个连续的锌指模体,最近的研究表明ZNF191是肝癌发生的相关基因。我们以人锌指蛋白基因ZNF191的cDNA为探针,筛选小鼠λ噬菌体基因组文库,意外地获得了1个与小鼠锌指蛋白基因ZF-12相类似的基因,多种组织的RT-PCR和启动子序列分析,暗示该基因不表达,且该基因无内含子,与ZF-12高度相似,存在突变,暗示其为与ZF-12相关的假基因序列,经查新证实它为新的序列后,以ZF12p(ZF-12 pseudogene)命名在GenBank登录(AY040222)。查寻GenBank的人类基因组库以及Southern结果显示人类基因组中无ZNF191假基因序列。ZF12p与ZF-12高度相似,暗示ZF12p在进化过程中产生的时间较晚,这对研究锌指蛋白基因ZF-12的突变与进化具有重要的意义。     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12的克隆与基因结构以及5′端启动子活性的分析

人类锌指蛋白ZNF191为类krueppel转录因子,其可能与神经精神病、心血管疾病和肝癌等疾病的发生或发展有关,为了采用基因敲除模型来探讨它的生理功能,克隆和定位其在模式生物（小鼠）中的同源基因,并阐明其结构特征是必需的。通过筛选小鼠λ噬菌体基因组文库,获得了它在小鼠中的同源基因ZF－12基因组全长片段。序列分析表明：该基因含有4个外显子和3个内含子,内含子都遵循GT／AG的剪接模式;第91密码子处存在单核苷酸多态性;可能存在2种大小不同的3′端的非翻译区（3′－UTR）;与锌指蛋白基因Zfp-35相连锁,可将其定位于18号染色体的B3－C带上或附近;5′端上游存在1个约250bp高度富含GC的启动子序列。ZF－12基因的5′端系列缺失荧光素酶基因报告载体的瞬时转染实验表明:其上游序列（-762～ 70bp）具有启动子转录活性,在更上游的序列（－824～-762bp)上可能存在负调控元件。这项研究结果为进一步的基因敲除研究奠定了基础。     

人类锌指结构新基因ZNF18的克隆和表达谱分析

在很多转录因子中发现的锌指结构,被认为在人类心脏的发育和相关疾病的发生过程中发挥重要的作用。本文报道了克隆和表达分析人类新的锌指蛋白基因ZNF18。该基因cDNA长2 767 bp,编码一个有549个氨基酸的蛋白,这一蛋白含有一个SCAN结构域,一个KRAB结构域和5个连续的C2H2型锌指结构域。ZNF18蛋白与小鼠Zfp535有77％的同源性。ZNF18基因定位于人染色体17p12~p13,包含9个外显子和8个内含子。以ZNF18全长编码区为探针进行Northern杂交,结果显示ZNF18在成体小鼠各组织中广泛表达,但在心脏中低丰度表达。整体原位杂交结果显示,ZNF18基因在小鼠胚胎的表达有很高的动态性。ZNF18主要在E7.5小鼠胚胎的胚外组织表达,E8.5出现了胚胎躯干前端表达。ZNF18从E9.0开始在胚胎的心脏和尾部表达,尤其在E10.5胚胎的心脏高丰度表达。这提示ZNF18基因与心脏发育过程可能有密切的关系。     

用人/啮齿类体细胞杂种系及荧光原位杂交将人类新基因ZNF191定位于染色体18q12.1

本文以锌指蛋白ZNF191全长cDNA为探针,与人/啮齿类体细胞杂种系DNA杂交,将这个新的人类锌指基因定位于18号染色体。又用该cDNA筛选人基因组DNA lambda/DASH文库,以获得的DNA片段为探针,进行人染色体荧光原位杂交(FISH)分析,将ZNF191基因精细定位在染色体18q 12.1区带。依据有关遗传连锁分析和等位基因荧光原位杂交(FISH),将ZNF191精确定位于人染色体18q12.1。通过遗传连锁及染色体杂合性丢失分析.目前已知多种遗传病和肿瘤与这个区域相关。因此,ZNF191基因可作为这些疾病或肿瘤的候选相关基因。     

毛竹抗逆锌指蛋白基因cDNA克隆与序列分析

根据水稻抗逆相关锌指蛋白基因的保守区序列设计引物,以毛竹基因组DNA和cDNA为模板,采用PCR方法,成功扩增出1个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为495bp,序列无内含子,共编码164个氨基酸,将其命名为PeZFP基因(GenBank登录号:FJ472953)。氨基酸序列(GenBank登录号:ACL01101)的分析结果表明,PeZFP与其他锌指结构蛋白有较高的同源性,同水稻锌指结构抗逆蛋白OSIAP1序列相似性高达87.7%,且其序列C端具有典型的AN1类型的锌指结构Cx2-4Cx9-12Cx2Cx4Cx2Hx5HxC,在N端具有典型的A20类型锌指蛋白结构,推测此PeZFP为植物抗逆OsIAP1类似基因,在功能上与毛竹抗逆性相关。     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立

利用小鼠锌指蛋白ZF－12基因组DNA片段,构建了针对小鼠ZF－12基因座的替换型打靶载体pSSC-TV-10.5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES人,经G418／GANC双药筛选和分子鉴定,获得4个ZF－12^ /-基因的ES细胞杂合子克隆,其生长状态良好,为进一步建立ZF－12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。     

人类锌指蛋白ZNF382对肌生成的调控作用

人类基因组中有大量哺乳类特有的KRAB锌指基因,这些基因的功能大多尚不清楚,ZNF382就是其中一个.本文研究了人类锌指蛋白ZNF382对肌生成的调控作用.人类ZNF382基因在肌肉组织中高表达,ZNF382的mRNA水平在C2C12细胞的肌生成过程中上调,ZNF382调节肌肉特异性基因的表达,在NIH3T3细胞中,ZNF382与E-box蛋白E12和成肌调节因子MyoD共转增强肌肉肌酸激酶MCK启动子的活性;ZNF382的启动子预测分析也发现ZNF382的启动子上含有MyoD和血清反应因子SRF的结合位点,这些结果提示人类ZNF382蛋白在肌生成中起着重要的作用.     

急性呼吸道感染儿童中WU多瘤病毒基因组序列特征分析

为了解从北京地区急性呼吸道感染儿童中发现的WU多瘤病毒的基因组编码特征,并对其进行基因序列多样性分析,应用针对基因组5'端非编码区、衣壳蛋白VP1、VP2编码基因以及LTAg编码基因的引物对,从已确证为WU病毒阳性的来自北京地区急性呼吸道感染儿童的编号为BJF5276的临床标本中经聚合酶链反应扩增得到预期的基因片段,直接测序后将序列拼接得到全基因组序列,进而推导其基因组编码特征;随后从其它21例已确证为WU多瘤病毒阳性的急性呼吸道感染儿童标本中扩增得到衣壳蛋白VP2编码区基因,进行基因序列测定以及基因序列多样性分析。得到了WU病毒BJF5276全基因组序列。序列分析结果显示WU病毒BJF5276基因组序列全长为5229bp,共有5个主要的CDS(Coding domain sequences),分别编码衣壳蛋白VP2、VP3、VP1,并以其互补序列为模板,编码STAg和LTAg;所得到的22例VP2蛋白编码区基因序列同源性比较结果显示病毒VP2基因编码区序列与GenBank中已有的64个序列之间同源性很高;Mega4.0NJ进化树(Neighbor-joiningtree)分析显示这22个VP2基因序列分属于不同的基因进化簇,其中20个序列属于进化簇I中的Ia,另外2个序列属于进化簇III,其中的一个序列在IIIb基因进化簇中,另外一个序列独立成簇,不属于现有的IIIa或IIIb,暂时将其命名为IIIc。本研究结果提示北京地区的WU病毒具有多瘤病毒科的基因组编码特性;序列非常保守,有分属于不同基因进化簇的WU病毒在北京地区流行,与文献报道的以Ib流行为主所不同的是北京地区的WU病毒以Ia为主,且有新的基因进化簇出现。     

昆明小鼠无毛基因cDNA全长序列的分子克隆

无毛基因是与皮肤和被毛结构有重要关联的核受体基因,编码一个锌指结构转录因子,是甲状腺激素受体的转录辅阻遏物,并参与毛发生长周期的调控,在维持毛囊及毛囊间上皮的增殖、分化、调亡的精致平衡中扮演重要角色。参考小鼠、人的无毛基因序列,用RT-PCR方法首次对昆明小鼠无毛基因的cDNA序列进行了克隆,获得了昆明小鼠无毛基因的全长4 014 bp cDNA序列（GenBank 登录号：AY547391）,基因的CDS长度为3 546 bp。AY547391基因编码的蛋白质在GenBank中的序号为AAT45233,由1181个氨基酸组成。昆明小鼠与国外报导的小鼠、大鼠、猪、羊、猴、人等6种动物CDS 序列同源性分别为99.9%、94.4%、83.1%、78.1%、81.9%、82.1%,氨基酸同源性分别是99.9%、92.2%、81.7%、 70.8%、 79.9%、 80.1% 。这一结果反应了无毛基因在进化过程的高度保守性。通过Blast比较昆明小鼠无毛基因与GenBank 数据库中收集的Hr 基因的mRNA,发现了4个SNP和一个缺失突变,其中3个位点没有改变氨基酸残基的性质,两个位点有氨基酸改变并证实为多态性突变位点,研究结果为无毛基因的SNPs的数据库提供了新的信息。     

Zif268基因突变体的克隆与真核表达载体的构建

以小鼠转录因子Zif268的三锌指DNA结合区为模板,利用重叠(Overlap)PCR技术,获得Zif268关键氨基酸位点同时突变的三锌指突变体ZF123、2ZF123。以ZFl23、2ZF123为模板,PCR扩增获得TAT—ZF123,TAT—2ZF123序列。构建表达质拉PET—28—a^ —TAT—ZF123,pET—28—a^ —TAT—2ZF123。为利用HIVTAT蛋白的跨膜功能,实现ZF123、2ZF123在哺乳动物细胞中的表达打下基础。     

Isolation, cloning, and expression of a new murine zinc finger encoding gene.

With the aim of identifying genes involved in cartilage differentiation, we have used a subtractive hybridization strategy with cDNAs from a chondrocytic cell line (MC615) and mRNAs from a mesenchymal precursor cell line (10T1/2). We have isolated a cDNA clone representing a novel mouse gene. The predicted 368-amino acid protein, designated ZF-12, contains four C(2)H(2)-type zinc finger motifs and one region homologous to the LeR domain, a finger-associated structural domain. ZF-12 mRNAs are expressed during embryonic development and in different organs in adult, including rib cartilage. These data suggest that ZF-12 might play an important role not only in cartilage differentiation, but also in basic cellular processes.     

Chromosomal localization of two human zinc finger protein genes, ZNF24 (KOX17) and ZNF29 (KOX26), to 18q12 and 17p13-p12, respectively

Two members of the zinc finger Krüppel family, ZNF24 (KOX17) and ZNF29 (KOX26), have been localized by somatic cell hybrid analysis and in situ chromosomal hybridization to human chromosomes 18q12 and 17p13-p12, respectively. The mapping of ZNF29 together with the previously reported localization of ZFP3 suggests that a zinc finger gene complex is located on human chromosome 17p. ZNF29 maps centromeric to the human p53 tumor antigen gene (TP53). In the analogous murine position, the two mouse zinc finger genes Zfp2 and Zfp3 have recently been assigned to the distal region of mouse chromosome 11, the murine homolog of human chromosome 17. Both human zinc finger genes ZNF24 and ZNF29 are in chromosomal regions that have been noted to be deleted in neoplasms of the lung and of the central nervous system at chromosome 17p and in colorectal neoplasia at chromosomes 17p and 18q.     

Assignment of a novel zinc finger gene ZNF191 to human chromosome 18Q12.1 by human/rodent somatic cell hybrid panel and fluorescent in situ hybridization]

A novel human zinc finger gene, ZNF191, was assigned to chromosome 18 by hybridization of human/rodent hybrid cell panel to a full-length cDNA as a probe. Meanwhile, a human genomic DNA lambda/DASH library was screened using this cDNA probe and several positive clones were obtained. Fluorescence in situ hybridization (FISH) was performed by using one of these positive clones, 16-1, as a probe. Thus, the ZNF191 gene was precisely mapped in 18q12. 1. To date, some hereditary diseases and tumors have been found to be associated with this region by analysis of genetic linkage and loss of heterozygosity. Hence, it suggested that the gene ZNF191 can be taken as a candidate gene responsible for those diseases and tumors.     

Overexpression and purification of single zinc finger peptides of human zinc finger protein ZNF191

ZNF191, a new human zinc finger protein, probably relates to some hereditary diseases and cancers. To obtain structural information of zinc finger domain a convenient method for obtaining milligram quantities of each zinc finger peptide of ZNF191 is necessary. Here, we report an Escherichia coli expression system for rapid and high-level expression of zinc finger 3 and zinc finger 4 of ZNF191. The gene of zinc finger 3 or zinc finger 4 was cloned into pET31b vector to allow expression of single zinc finger peptide as a ketosteroid isomerase (KSI) fusion protein. The KSI-single zinc finger fusion protein was overexpressed in the form of inclusion body, which can be purified by washing several times using buffer solutions, and then be cleaved directly by cyanogen bromide to release single zinc finger peptide. The more than 20mg/L yield of single zinc finger peptide was achieved with more than 95% purity by using YM ultrafiltration membranes. Circular dichroism spectra of these two single zinc finger peptides titrated with Zn(2+) ions demonstrate that they have different secondary structures.