近零磁场下粘虫雌蛾内参基因转录表达稳定性评价

【目的】筛选近零磁场下粘虫Mythimnaseparata雌蛾内稳定表达的内参基因,为在近零磁场下的粘虫靶标基因表达的定量分析准确性提供依据。【方法】利用亥姆霍兹线圈产生近零磁场,分别在近零磁场(<500nT)和地磁场(约50μT)2种磁场强度下饲养粘虫。采用qRT-PCR技术测定2种磁场强度下饲养的粘虫初羽化雌蛾10种内参基因:β-肌动蛋白(β-Actin)、β-微管蛋白(β-TUB)、TATA盒结合蛋白(TBP)、延伸因子(EF-1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、28S核糖体RNA(28SrRNA)、cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)、核糖体蛋白L12(RPL12)和腺苷三磷酸酶(ATPase)的定量表达,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线综合分析系统RefFinder内参筛选分析软件分别对2种磁场强度下粘虫的内参基因稳定性进行评估筛选。【结果】β-Actin和18S rRNA的稳定性在NormFinder结果中居于前两位,geNorm和BestKeeper结果中β-Actin和PKG基因稳定性最好,RefFinder综合分析表明,β-Actin稳定性最好,其次为18S rRNA和PKG基因,β-TUB和TBP的表达稳定性在三个软件分析结果中都较差。geNorm软件进一步对内参基因的分析表明引入β-Actin和18S rRNA两个内参基因最佳。【结论】明确了近零磁场强度下适用于粘虫初羽化雌成虫稳定表达的内参基因,确保了近零磁场下粘虫靶标基因转录表达水平的准确测定,为粘虫磁感受分子机制研究提供了重要工具。     

冬虫夏草菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

以冬虫夏草单子囊孢子分离得到的菌株TZ8-1的3种菌丝形态为实验材料,提取RNA,经反转录获取cDNA,选择了11个持家基因为候选内参基因（18S rRNA、APRTase、β-TUB、RPL2、EF1-α、PGI、PGM、H⁺-ATPase、ACT1、UBQ和GAPDH）,根据该菌基因组注释结果来设计引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行定量扩增,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper算法程序进行表达稳定性评估,并用RefFinder对评估结果进行综合排比,最终筛选得到了最适内参基因。结果表明,所选取的11个候选内参基因均可作为冬虫夏草菌菌丝体时期的内参基因,稳定性最好的3个内参基因分别是UBQ、PGE和ACT1,稳定性较差的3个内参基因分别是GAPDH、RPL2和β-TUB。     

蜜环菌(Armillaria mellea)内参基因的筛选

[背景]蜜环菌属(Armillaria)是一类营腐生或寄生生活的药食两用型真菌,研究其功能基因表达具有重要意义。[目的]筛选并获得蜜环菌(Armillaria mellea)最稳定的内参基因。[方法]以蜜环菌(A.mellea)541为研究对象,以马铃薯琼脂糖培养基培养的菌丝和菌索为对照组,以添加还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶抑制剂氯化二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium chloride,DPI)培养的菌丝和菌索为抑制剂组,以添加木屑培养的菌丝和菌索为诱导剂组,利用RT-qPCR技术和BestKeeper程序系统评估候选内参基因ACT-1、α-TUB、β-TUB 1、γ-TUB、UBQ、EF-lγ、18S rRNA biogenesis protein基因(18S rRNA BP)和GAPDH的表达量稳定性。[结果]内参基因EF-1γ在对照组、DPI抑制剂组和木屑诱导剂组中的表达量稳定性最好。[结论]EF-1γ为蜜环菌(A.mellea)的最佳内参基因,为蜜环菌属真菌功能基因表达研究提供了参考。     

夜香树花期荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选夜香树（Cestrum nocturnum L.）香气释放、生物钟等相关基因表达研究适用的内参基因,本研究采用夜香树盛花期叶片和花为实验材料,利用同源克隆和RACE技术,获得了夜香树6种经典的内参基因序列,分别为：Actb7、EF-1A、GAPDH、TUA、TUB2、UBQ;采用荧光定量PCR方法对18s rRNA和这6个内参基因的表达模式进行了分析,并通过Bestkeeper、geNorm、NormFinder 3种程序分析了内参基因的稳定性。结果表明,在花中,Actb7表达最稳定;在叶片中,EF-1A和UBQ的表达比较稳定;在2种组织中,EF-1A的表达相对稳定。3组稳定性分析中,geNorm程序确定的最佳内参基因数目均为2,最佳内参基因组合均为Actb7/EF-1A。本研究通过对稳定内参基因的筛选,以期为准确检测夜香树盛花期花瓣节律运动、香气释放、生物钟变化等相关基因的表达研究奠定基础。     

翘嘴鳜per1 mRNA表达量分析中采用的内参基因稳定性比较

为筛选生物钟核心基因per1表达定量中的相对稳定性最好的内参基因,本研究取翘嘴鳜成鱼心脏、肝脏、肾脏、脑、红肌、白肌、肠、眼和脾等九个组织为研究对象,选取GAPDH、18S rRNA、β-actin、rps29、RPL13a、B2M和EF1a为内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对per1基因mRNA表达水平进行检测分析。研究结果表明18S rRNA和GAPDH的平均稳定值M最低,相对表达量最稳定。以18S rRNA和GAPDH为内参基因时分析发现per1基因表达量在肝脏中最高。本研究为在鱼类per1 mRNA表达检测过程中选用稳定的内参基因提供了实验和理论参考。     

紫玉兰‘红元宝''花芽分化阶段基因定量分析的内参基因筛选

为筛选紫玉兰‘红元宝’(Magnolia liliflora‘Hongyuanbao’)二次花芽分化阶段稳定表达的内参基因,该研究以‘红元宝’不同花芽分化时期的花芽和叶为材料,基于转录组数据,筛选出8个候选内参基因,即泛素酶基因(UBC)、肌动蛋白(ACT)、微管蛋白β链(β-TUB)、微管蛋白β-5链(β-TUB5)、微管蛋白α-3链(α-TUB3)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、酰基载体蛋白2(ACP2)、酰基载体蛋白3(ACP3)。运用Primer Premier 5设计引物,简单克隆和熔解曲线验证引物特异性;利用qRT-PCR技术检测各个候选内参基因的表达情况,结合GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件和RefFinder在线工具综合评估其表达稳定性,并通过目的基因TFL1的表达分析验证其可靠性。结果表明:(1)8个候选内参基因条带位置正确,熔解曲线呈单一峰,说明引物特异性良好。(2)β-TUB、β-TUB5和α-TUB3是‘红元宝’不同花芽分化时期较为稳定的内参基因,而UBC和ACT为稳定性最低的内参基因。(3)β-TUB5、α-TUB3、β-TUB及其组合的相对表达量趋于一致,而ACT和UBC并未对目的基因的表达量进行有效的标准化。因此,β-TUB、β-TUB5和α-TUB3可作为‘红元宝’二次花芽分化研究中稳定表达的内参基因。该研究结果将为木兰属植物二次成花分子调控机制研究提供依据。     

五龄飞蝗不同发育时间实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选5龄飞蝗不同发育时间的最适内参基因,为相关研究提供基础数据。【方法】本文选取β-肌动蛋白(β-actin)、延长因子(EF-1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白49(RP49)、α-微管蛋白(α-Tubulin)和18S核糖体RNA(18S rRNA)基因作为候选内参基因,运用实时定量PCR(qPCR)方法研究各基因在5龄飞蝗不同发育时间的相对表达量,用geNorm与Normfmder软件分析这6个基因表达稳定性。【结果】geNorm分析结果显示6个内参基因表达稳定度M值顺序为:β-actin(0.3720)>RP49(0.3750)>α-Tubulin(0.4030)>18S rRNA(0.4270)>EF-1α(0.4970)>GAPDH(0.6040)。M值越小表示基因表达稳定度越高,同时geNorm软件以标准化因子配对差异值(Pairwise variations)0.15默认为取舍值,由于V2/3=0.098<0.15,所以最适内参基因数目为2个。运用NormFinder软件也得出相似的结果。【结论】β-actin与RP49为5龄飞蝗不同发育时间的最适内参基因。     

苯酚胁迫下多刺裸腹溞实时定量PCR内参基因的筛选

为研究苯酚胁迫下多刺裸腹溞(Moina macrocopa)相关基因的表达情况, 筛选用于实时定量PCR分析的最佳内参基因。利用内参基因表达的cycle threshold(Ct值)非参数检验、GeNorm、NormFinder和BestKeeper四种方法对β-actin、16S rRNA和12S rRNA进行分析, 筛选出苯酚胁迫下多刺裸腹溞表达相对稳定的内参基因。结果显示, 从Ct值初步判定不同浓度苯酚胁迫后, 多刺裸腹溞体内β-actin、16S rRNA和12S rRNA均可稳定表达, 且稳定性顺序为: 16S rRNA>12S rRNA>β-actin, 从GeNorm软件分析显示内参基因的稳定性顺序为: 16S rRNA=β-actin>12S rRNA, NormFinder和Bestkeeper分析显示的稳定性顺序均为: 16S rRNA>β-actin>12S rRNA。基于以上四种方法对三个候选内参基因的筛选, 确定了16S rRNA作为多刺裸腹溞实时定量PCR的最佳内参基因, 有助于提高qRT-PCR分析的准确性, 为进一步研究苯酚胁迫多刺裸腹溞后目的基因功能的表达提供了基础。     

光裸星虫(Sipunculus nudus)不同发育时期卵细胞内参基因的筛选

内参基因的选择对功能基因表达量的归一化处理尤为重要。为了筛选出光裸星虫不同发育时期卵子的最适内参基因,利用qRT-PCR测定了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肽基脯氨酰顺反异构酶A(PPIA)、60S核糖体蛋白L10(60S-L10)、铁蛋白(Ferritin)、β-肌动蛋白(β-actin)、泛素C(UBC)、真核生物翻译起始因子(eIF)、NADH脱氢酶(NDH)、28S核糖体RNA(28S)、TATA盒结合蛋白(TBP)、18S核糖体RNA(18S)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)共12个候选内参基因的表达水平,并通过4个程序(geNorm,NormFinder,BestKeeper以及RefFinder)综合分析了各基因的表达稳定性。结果显示:(1)12个候选内参基因均能获得特异性扩增产物,但表达情况各异;(2)对候选内参基因进行综合打分,得到候选内参基因稳定性排名为18S>GAPDH>28S>β-actin>UBC>e IF>NDH|TBP>PPIA|Ferritin>60S-L10>SDHA。18S和GAPDH稳定性较好,可作为不同发育时期卵细胞基因表达研究的单内参基因,或最优组合内参基因。     

松墨天牛化学感受组织荧光定量PCR内参基因的鉴定与筛选

【目的】本研究拟选择适合用于分析松墨天牛Monochamus alternatus化学感受组织中基因表达的内参基因。【方法】依据转录组测序结果进行内参基因鉴定,利用RT-q PCR技术分析内参基因在松墨天牛不同发育阶段和不同性别化学感受组织间的表达差异,并利用软件ge Norm,Norm Finder和Best Keeper比较其表达的稳定性。【结果】松墨天牛转录组中鉴定出9个候选内参基因(Actin,TUB,18S rRNA,RPS27A,RPS3,RPL10,AK,GAPDH和EF1A),其中后7个候选内参基因在松墨天牛中被首次鉴定,松墨天牛候选内参基因和其他昆虫相应基因的同源性很高。9个候选内参基因引物均具有良好的扩增效率,18S rRNA的表达水平最高,EF1A的表达水平最低;18S rRNA和Actin在不同样品间的表达水平差异最大,GAPDH和TUB表达水平在不同样品间差异最小。ge Norm和Norm Finder软件分析认为,GAPDH是最稳定的内参基因,TUB是较为稳定的内参基因,18S rRNA和Actin是最不稳定的内参基因;Best Keeper软件分析认为,GAPDH和TUB是合适的内参基因,18S rRNA和Actin是不适合的内参基因。最适合校正松墨天牛化学感受组织中基因表达数据的内参基因数量为2个,即GAPDH和TUB,并且这样的内参基因组合可以用于不同发育阶段和不同性别的不同化学感受组织。【结论】本研究结果为利用RT-q PCR技术准确分析松墨天牛和其他天牛基因包括化学感受组织基因相对表达量的内参基因选择提供了重要参考。     

草菇不同菌株RT-qPCR参考基因筛选

适合的参考基因是应用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术进行基因表达分析的前提。本研究以7个食用菌常用参考基因(β-TUB 1、GPD、ACTB、Ras、α-TUB、β-TUB 2和SPRYp)为候选基因,利用RT-qPCR检测其在草菇常用生产菌株(CPS)V844、V5、V971和V844继代退化菌株(SDS) T8、T12、T16、T20中的表达;用Genorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件分析候选基因的表达稳定性,并结合几何平均数法筛选出最佳参考基因。结果表明,SPRYp、α-TUB和β-TUB 2基因适用于草菇常用生产菌株检测,SPRYp、GPD和α-TUB基因适用于草菇继代退化检测,SPRYp基因适用于两种条件的检测。两两差异分析表明,草菇常用生产菌株的最佳参考基因组合为SPRYp、α-TUB和β-TUB 2,继代退化菌株的最佳参考基因组合为SPRYp和GPD,两种条件混合菌株的最佳参考基因组合为SPRYp和α-TUB。