近零磁场下粘虫雌蛾内参基因转录表达稳定性评价

【目的】筛选近零磁场下粘虫Mythimnaseparata雌蛾内稳定表达的内参基因,为在近零磁场下的粘虫靶标基因表达的定量分析准确性提供依据。【方法】利用亥姆霍兹线圈产生近零磁场,分别在近零磁场(<500nT)和地磁场(约50μT)2种磁场强度下饲养粘虫。采用qRT-PCR技术测定2种磁场强度下饲养的粘虫初羽化雌蛾10种内参基因:β-肌动蛋白(β-Actin)、β-微管蛋白(β-TUB)、TATA盒结合蛋白(TBP)、延伸因子(EF-1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、28S核糖体RNA(28SrRNA)、cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)、核糖体蛋白L12(RPL12)和腺苷三磷酸酶(ATPase)的定量表达,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线综合分析系统RefFinder内参筛选分析软件分别对2种磁场强度下粘虫的内参基因稳定性进行评估筛选。【结果】β-Actin和18S rRNA的稳定性在NormFinder结果中居于前两位,geNorm和BestKeeper结果中β-Actin和PKG基因稳定性最好,RefFinder综合分析表明,β-Actin稳定性最好,其次为18S rRNA和PKG基因,β-TUB和TBP的表达稳定性在三个软件分析结果中都较差。geNorm软件进一步对内参基因的分析表明引入β-Actin和18S rRNA两个内参基因最佳。【结论】明确了近零磁场强度下适用于粘虫初羽化雌成虫稳定表达的内参基因,确保了近零磁场下粘虫靶标基因转录表达水平的准确测定,为粘虫磁感受分子机制研究提供了重要工具。     

Bt毒素诱导下小菜蛾实时定量PCR 内参基因的筛选

【目的】筛选出Bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella (L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA (18S rRNA)、 肌动蛋白（ACTB）、 延伸因子（EF1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、 核糖体蛋白L32 (RPL32)、 核糖体蛋白S13 （RPS13）、 核糖体蛋白S20 （RPS20）和β-微管蛋白(TUB)基因作为候选内参基因, 以geNorm、 Normfinder和BestKeeper软件分析这8个基因在Bt毒素诱导后的小菜蛾不同品系中肠组织中的表达稳定性。并应用筛选出来的内参基因分析小菜蛾氨肽酶2（aminopeptidase N2, APN2）基因的表达水平。【结果】geNorm软件以RPS13和EF1为最稳定内参基因, NormFinder和BestKeeper软件均以RPS13和RPL32为最稳定基因。使用3种不同内参基因分析Bt毒素诱导后的小菜蛾Bt抗性和敏感品系中ANP2表达水平时, 新的内参基因EF1和传统内参基因RPL32表现了良好的稳定性, 二者作为标准化因子, ANP2表达量结果基本一致, 而使用18S rRNA作为内参基因, 却导致部分表达量分析结果有所误差。【结论】筛选出PRS13,RPL32和EF1可以作为小菜蛾某些试验条件下的内参基因, 对小菜蛾基因表达研究奠定了一定基础, 也对其他昆虫内参基因的筛选具有参考价值。     

褐飞虱热胁迫下内参基因的筛选及热激蛋白基因表达分析（英文）

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)是为害水稻的重要害虫之一,温度是影响其暴发、迁飞的主要环境因子之一。本研究旨在探讨研究褐飞虱对高温胁迫适应性的热激蛋白基因表达调控模式。【方法】分别以不同的高温(30℃~40℃)处理褐飞虱雌、雄虫1 h和2 h,利用荧光定量PCR技术检测其体内的β-actin 1,β-actin2,β-actin3,28S rRNA,18S rRNA和α-2-tubulin 6个内参基因的表达量,用geN orm和BestK eeper软件分析确定最稳定表达的内参基因,并检测热胁迫后hsp70和hsp90基因在处理褐飞虱成虫体内的表达模式。【结果】geN orm软件分析结果表明,热胁迫后褐飞虱内参基因稳定性在雌虫体内为:β-actin1=β-actin328S rRNAα-2-tubulin18S rRNAβ-actin2;在雄虫体内为:β-actin1=β-actin3α-2-tubulin28S rRNA18S rRNAβ-actin2。BestK eeper软件分析结果显示,在热胁迫的雌、雄虫体内β-actin1均最稳定,18S rRNA次之,β-actin2最不稳定。两种软件分析结果基本一致。以β-actin1为校正内参基因,荧光定量PCR分析hsp70和hsp90在不同热胁迫条件下的表达模式,结果表明,各高温处理下hsp70表达量与对照26℃下的表达量没有显著性差异;而hsp90基因表达模式表现为被高温诱导上调表达,在雌、雄虫体内表达量达到最高的处理条件分别为40℃和38℃处理2 h。【结论】β-actin1基因可以作为热胁迫下褐飞虱雌雄虫体内基因表达模式分析的校正内参基因使用。褐飞虱hsp90基因能被高温诱导表达,该基因可能在褐飞虱适应热胁迫过程中起着重要的作用。     

大灰象甲实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出适合分析大灰象甲Sympiezomias velatus成虫不同组织中基因表达水平的内参基因。【方法】利用转录组测序技术获得大灰象甲管家基因序列作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析候选基因在大灰象甲雌雄成虫触角、头、胸、腹和足中的表达量;并利用geNorm, NormFinder和BestKeeper软件及在线工具RefFinder评价候选基因的表达稳定性。以大灰象甲气味结合蛋白1(odorant bindng protein 1, OBP1)基因为目标基因验证候选基因在大灰象甲成虫不同组织中的表达稳定性。【结果】基于大灰象甲转录组数据首次鉴定得到β-肌动蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、60S核糖体蛋白L12基因(RPL12)、60S核糖体蛋白L32基因(RPL32)、40S核糖体蛋白S20基因(RPS20)、延伸因子2基因(EF2)、α-微管蛋白基因(TUA)和β-微管蛋白基因(TUB)共9个管家基因序列。geNorm分析结果显示,RPL12和RPS20是最稳定表达的内参基因,而BestKeeper和NormFinder分析结果显示最稳定表达的内参基因分别是TUA和TUB。综合各分析方法得出9个候选基因中TUB,TUA,RPS20和RPL12是最稳定表达的内参基因,而18S rRNA,ACT和GAPDH这3个广泛应用的内参基因则表现出最低的表达稳定性。最后以OBP1为目标基因对稳定性不同的4个候选基因进行稳定性验证,发现以TUB和RPL12为内参基因,OBP1在成虫不同组织之间的表达模式基本一致;而以RPL32为内参基因,表达模式与应用TUB作为内参基因时稍有不同,使用18S rRNA作为内参基因得到的OBP1表达模式则与应用TUB作为内参基因时的完全不一致。【结论】TUB,TUA,RPS20和RPL12可以作为分析大灰象甲成虫不同组织中基因表达水平的内参基因,为后续基因表达研究奠定了基础。     

光裸星虫(Sipunculus nudus)不同发育时期卵细胞内参基因的筛选

内参基因的选择对功能基因表达量的归一化处理尤为重要。为了筛选出光裸星虫不同发育时期卵子的最适内参基因,利用qRT-PCR测定了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肽基脯氨酰顺反异构酶A(PPIA)、60S核糖体蛋白L10(60S-L10)、铁蛋白(Ferritin)、β-肌动蛋白(β-actin)、泛素C(UBC)、真核生物翻译起始因子(eIF)、NADH脱氢酶(NDH)、28S核糖体RNA(28S)、TATA盒结合蛋白(TBP)、18S核糖体RNA(18S)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)共12个候选内参基因的表达水平,并通过4个程序(geNorm,NormFinder,BestKeeper以及RefFinder)综合分析了各基因的表达稳定性。结果显示:(1)12个候选内参基因均能获得特异性扩增产物,但表达情况各异;(2)对候选内参基因进行综合打分,得到候选内参基因稳定性排名为18S>GAPDH>28S>β-actin>UBC>e IF>NDH|TBP>PPIA|Ferritin>60S-L10>SDHA。18S和GAPDH稳定性较好,可作为不同发育时期卵细胞基因表达研究的单内参基因,或最优组合内参基因。     

桃蛀螟实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选特定条件下桃蛀螟Conogethes punctiferails稳定表达的内参基因,为桃蛀螟基因定量研究奠定基础。【方法】参考文献报道,并根据桃蛀螟转录组测序结果筛选出β-肌动蛋白基因ACT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、核糖体蛋白49基因RP49、α-微管蛋白基因α-tub、核糖体蛋白L13基因RPL13和液泡型ATP合酶基因V-ATPase等6个候选基因。再利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定6个候选基因在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中的表达量;然后通过ΔCt法,Ge Norm,Norm Finder,Best Keeper和Ref Finder 5个软件对6个候选基因的稳定性进行评估;最后以桃蛀螟嗅觉受体基因(olfactory receptor co-receptor,Orco)和性信息素结合蛋白基因(pheromone binding protein1,PBP1)为目的基因,验证6个候选基因分别在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中的的稳定性。【结果】ΔCt法,Ge Norm,Norm Finder和Best Keeper分析结果表明,4个软件对6个候选基因稳定性的排序相似,在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中稳定性较高的3个基因为RP49,RPL13和GAPDH;同时4个软件均判定ACT的稳定性最低。进一步利用Ref Finder进行综合分析,结果显示,在桃蛀螟成虫不同组织中,最稳定的基因为RPL13,其次为RP49;而在不同发育时期,最稳定的基因为RP49,其次为GAPDH。另外经Ge Norm软件计算得出,在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中桃蛀螟内参基因的最佳数目为2。最后,以嗅觉受体基因Orco和PBP1为目的基因,对筛选出的候选基因的稳定性进行验证,发现当使用RPL13和RP49以及RP49和GAPDH作为内参基因时,Orco及PBP1的表达量规律一致,并与桃蛀螟生活习性及前人研究结果一致;而使用ACT作为内参基因计算得到的Orco和PBP1表达量则不规律。【结论】在不同发育时期桃蛀螟基因定量研究中建议以RP49和GAPDH作为内参基因,而在桃蛀螟成虫不同组织中基因定量研究中建议以RPL13和RP49作为内参基因。     

苯酚胁迫下多刺裸腹溞实时定量PCR内参基因的筛选

为研究苯酚胁迫下多刺裸腹溞(Moina macrocopa)相关基因的表达情况, 筛选用于实时定量PCR分析的最佳内参基因。利用内参基因表达的cycle threshold(Ct值)非参数检验、GeNorm、NormFinder和BestKeeper四种方法对β-actin、16S rRNA和12S rRNA进行分析, 筛选出苯酚胁迫下多刺裸腹溞表达相对稳定的内参基因。结果显示, 从Ct值初步判定不同浓度苯酚胁迫后, 多刺裸腹溞体内β-actin、16S rRNA和12S rRNA均可稳定表达, 且稳定性顺序为: 16S rRNA>12S rRNA>β-actin, 从GeNorm软件分析显示内参基因的稳定性顺序为: 16S rRNA=β-actin>12S rRNA, NormFinder和Bestkeeper分析显示的稳定性顺序均为: 16S rRNA>β-actin>12S rRNA。基于以上四种方法对三个候选内参基因的筛选, 确定了16S rRNA作为多刺裸腹溞实时定量PCR的最佳内参基因, 有助于提高qRT-PCR分析的准确性, 为进一步研究苯酚胁迫多刺裸腹溞后目的基因功能的表达提供了基础。     

梨小食心虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】本研究旨在探明梨小食心虫Grapholita molesta在不同发育阶段、成虫不同组织以及不同浓度的3种杀虫剂处理后成虫中稳定表达的内参基因,为后续对梨小食心虫目的基因表达的研究奠定基础。【方法】基于梨小食心虫转录组数据筛选10个候选内参基因(β-actin, 18S rRNA,β-tubulin,EF-1α,RPL13,RPL32,RSPL40,UBC7,α-tubulin和RPS20);通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定候选内参基因在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(头、前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、精巢和卵巢)以及不同浓度的3种杀虫剂(阿维菌素：19.819, 72.897和179.663μg/mL;吡虫啉：17.638, 163.323和762.986μg/mL以及高效氯氟氰菊酯：33.791, 96.123和198.282μg/mL)通过玻璃管药膜法处理后成虫中的表达量;利用geNorm, NormFinder,ΔCt, BestKeeper和RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评价。选择梨小食心虫细...     

微孢子感染东亚飞蝗实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出微孢子Paranosema locustae感染条件下东亚飞蝗Locusta migratoria实时定量PCR最适内参基因。【方法】本研究应用实时荧光定量PCR技术测定东亚飞蝗甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18s核糖体RNA(18s RNA)、微管蛋白基因(Tubulin,TUB)、肌动蛋白基因(Actin,ACT)和延伸因子1基因(Elongation factor1,EF1)5个候选基因在3个微孢子浓度(1×10~4、1×10~6和1×10~8个孢子/头)感染12 d后的表达稳定性;应用ge Norm、Bestkeeper和Normfinder 3个软件综合分析5个内参基因的稳定性。【结果】ge Norm软件对5个内参基因在不同微孢子虫浓度感染下稳定性分析结果表明:18S基因稳定性最低,平均表达稳定性值M值最高为0.658 4,TUB基因稳定性最高,M值最低为0.278 4。Norm Finder软件分析在不同微孢子虫浓度感染下的5个内参基因的稳定值分别为0.152(EF1)、0.181(ACT)、0.212(TUB)、0.329(GAPDH)和0.395(18S),可知内参基因稳定性顺序为:EF1>ACT>TUB>GAPDH>18S。由Best Keeper软件分析表明5个候选内参基因的SD值均小于1.0,表达均较稳定。根据其变异系数值CV的大小可知,ACT基因最为稳定。【结论】综合3种软件分析结果,在不同微孢子虫浓度感染下,可选择的较为稳定的内参基因ACT、EF1和TUB基因作为相对定量的参照基因。     

鳜鱼基因表达转录分析中的内参选择比较

目前基因表达的转录分析多采用单一或多个看家基因作为内参来校正目的基因的表达量。该实验以鳜鱼6个不同组织和5个不同胚胎发育阶段为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,观察了GAPDH、β-actin和18S rRNA三个看家基因mRNA水平的表达情况。geNorm统计分析表明,胚胎发育阶段β-actin表达最为稳定;不同的组织样品间,GAPDH表达最为稳定;而18S rRNA 的表达在不同的发育阶段不稳定。当利用多基因作为内参时,使用两个最稳定表达的看家基因即可对目的基因的表达进行准确校正。该结果证实了基因表达转录分析中内参基因选择的必要性,同时为鳜鱼等鱼类基因表达分析时内参基因的选择提供有价值的参考     

实时定量PCR构建法夫酵母内参基因β-actin、 gpd、18S rRNA标准品质粒和标准曲线

为建立检测法夫酵母JMU-MVP14中虾青素合成相关基因在不同生长时期表达水平的实时定量PCR方法,构建法夫酵母JMU-MVP14的管家基因β-actin、gpd、18S rRNA的标准质粒,进行实时定量PCR,制作标准曲线及回归方程.β-actin基因标准曲线相关系数（R2）=0.9956,扩增效率（E） =96.93％;gpd基因标准曲线相关系数（R2） =0.9901,扩增效率（E） =93.78％;18S rRNA基因标准曲线相关系数（R2） =0.9981,扩增效率（E）=98.76％.3个基因片段的熔解曲线均呈单峰;扩增曲线呈典型的S型动力学曲线,指数期和平台期明显,为理想的熔解曲线和扩增曲线.用geNorm软件对三个管家基因的稳定性进行分析,三个基因的稳定性排序为β-actin＞ 18S rRNA＞ gpd,故β-actin和18S rRNA较适合作为研究法夫酵母JMU-MVP14定量实验的内参基因.     

茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析（qRT-PCR）准确性的先决条件。该文以茶树（Camellia sinensis）芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术,分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。经GeNorm和NormFinder软件分析发现,当利用荧光定量PCR分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时,可选择β-actin作为校正内参基因;而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时,可以选择GAPDH作为校正内参基因。     

翘嘴鳜per1 mRNA表达量分析中采用的内参基因稳定性比较

为筛选生物钟核心基因per1表达定量中的相对稳定性最好的内参基因,本研究取翘嘴鳜成鱼心脏、肝脏、肾脏、脑、红肌、白肌、肠、眼和脾等九个组织为研究对象,选取GAPDH、18S rRNA、β-actin、rps29、RPL13a、B2M和EF1a为内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对per1基因mRNA表达水平进行检测分析。研究结果表明18S rRNA和GAPDH的平均稳定值M最低,相对表达量最稳定。以18S rRNA和GAPDH为内参基因时分析发现per1基因表达量在肝脏中最高。本研究为在鱼类per1 mRNA表达检测过程中选用稳定的内参基因提供了实验和理论参考。     

实时荧光定量PCR分析中毛果杨内参基因的筛选和验证

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术具有高灵敏性、高保真性和高特异性, 被广泛应用于基因表达的分析。在数据处理过程中, 选用稳定表达的基因作为内参基因对准确分析实验结果非常关键。以毛果杨(Populus trichocarpa)的不同组织以及锌胁迫下的组培苗为材料, 使用荧光定量PCR方法分析了TUA8、TUB6、ubiquitin、GAPDH、actin、18S rRNA和EF1α 7个看家基因的表达情况。通过geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个程序的综合分析, 发现actin、ubiquitin、EF1α和18S rRNA的稳定性较好, 可用作毛果杨基因表达研究的内参基因; 而TUB6在不同组织中稳定性最差; GAPDH在锌胁迫下的组织中稳定性最差, 因此不适宜作为内参基因。毛果杨NAC基因的表达分析, 进一步验证了上述结果。该研究对采用qRT-PCR方法分析毛果杨基因表达过程中内参基因的选择具有指导作用, 同时对揭示NAC基因的功能也有一定的意义。     

Validation of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR in Bovine PBMCs Transformed and Non-transformed by Theileria annulata

Theileria annulata is a tick-borne intracellular protozoan parasite that causes tropical theileriosis, a fatal bovine lymphoproliferative disease. The parasite predominantly invades bovine B lymphocytes and macrophages and induces host cell transformation by a mechanism that is not fully comprehended. Analysis of signaling pathways by quantitative real-time PCR (qPCR) could be a highly efficient means to understand this transformation mechanism. However, accurate analysis of qPCR data relies on selection of appropriate reference genes for normalization, yet few papers on T. annulata contain evidence of reference gene validation. We therefore used the geNorm and NormFinder programs to evaluate the stability of 5 candidate reference genes; 18S rRNA, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ACTB (β-actin), PRKG1 (protein kinase cGMP-dependent, type I) and TATA box binding protein (TBP). The results showed that 18S rRNA was the reference gene most stably expressed in bovine PBMCs transformed and non-transformed with T. annulata, followed by GAPDH and TBP. While 18S rRNA and GAPDH were the best combination, these 2 genes were chosen as references to study signaling pathways involved in the transformation mechanism of T. annulata.