pICln蛋白与低渗透压关系的初步研究

目的 :初步探讨pICln在低渗透压下的作用和变化。方法 :低渗处理pICln表达的大肠杆菌及LLC PK1细胞 ,测定大肠杆菌培养物的光密度及pICln在LLC PK1细胞的胞质及膜两相的分布。结果 :pICln表达的大肠杆菌的繁殖率明显高于对照组 ;低渗培养时LLC PK1细胞的pICln在胞质中明显增加。结论 :pICln具有抗肿胀、保护细胞的作用 ,它可能作为胞质调节蛋白来对抗低渗。     

PRKAG2-AS1通过AMPK抑制缺氧所致心肌细胞凋亡

目的:探讨PRKAG2-AS1在缺氧所致心肌细胞凋亡中的作用及其可能机制。方法:以人心肌细胞系作为主要研究对象,使用RNA核质分提的方法检测PRKAG2-AS1在细胞中的表达分布模式。将人心肌细胞系分为常氧对照组及低氧组,分别置于常氧环境(21% O2)和低氧环境(1% O2)培养12小时,构建心肌细胞缺氧模型,AnnexinV-FITC/PI流式细胞学检测细胞凋亡,Real-time PCR检测模型中SOD mRNA及PRKAG2-AS1基因表达。对常氧培养条件下心肌细胞通过siRNA及反寡义核苷酸方法分别靶向敲低胞质及胞核内PRKAG2-AS1的表达水平,AnnexinV-FITC/PI流式细胞学检测细胞凋亡,观察PRKAG2-AS1对心肌细胞凋亡的影响;Real-time PCR检测SOD mRNA表达,Western blot检测AMPKγ2亚基蛋白的表达,观察PRKAG2-AS1对SOD mRNA及AMPKγ2蛋白表达的影响。结果:PRKAG2-AS1在心肌细胞胞质及胞核中均有表达,且以胞核为主。PRKAG2-AS1基因表达水平在心肌细胞缺氧模型中明显降低(P<0.05)。对常氧培养条件下心肌细胞,敲低PRKAG2-AS1基因表达,将导致细胞凋亡增加(P<0.05),且敲低胞核中表达细胞凋亡更为明显,同时,敲低PRKAG2-AS1能够引起SOD mRNA表达水平改变(P<0.05),且AMPKγ2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:PRKAG2-AS1可能通过AMPK途径影响SOD表达,从而调控心肌缺氧损伤中的细胞凋亡。     

外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置:胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和用途 。     

APE/REF-1在胃黏膜上皮细胞系的表达

目的研究人胃黏膜上皮细胞系无嘌呤无嘧啶核酸内切酶(APE)的表达状况。方法人胃癌细胞系SGC-7901细胞、MKN45细胞和正常胃黏膜上皮细胞系HFE145细胞、GES-1细胞分别进行爬片培养,用细胞免疫组织化学方法检测APE表达水平。结果APE在MKN45细胞主要是胞核弱阳性表达,部分胞质有轻度表达;SGC-7901细胞胞核强阳性表达,个别细胞有胞质表达;HFE-145细胞中绝大部分细胞核呈阳性表达,胞质呈弱阳性表达;GES-1细胞主要是分裂期的细胞呈胞核和胞质的阳性表达。结论APE在人胃黏膜上皮细胞系普遍表达,以胞核表达为主,其表达方式可能与细胞的增殖和分化状态相关。     

esiRNA分析人源驱动蛋白MKLP1在胞质分裂中的功能

为探讨人源驱动蛋白MKLP1在有丝分裂和胞质分裂中的作用,以E.coliRNaseⅢ制备MKLP1的3′UTResiRNA转染HeLa细胞,通过定量RTPCR、Western印迹检测MKLP1esiRNA对MKLP1基因的沉默效率.再利用FACS分析、免疫荧光染色和活细胞成像分析检测MKLP1表达缺失后在有丝分裂和胞质分裂不同时期的细胞形态学、细胞分裂指数、细胞百分数,动态观察有丝分裂和胞质分裂期间的表型改变,以系统分析MKLP1的功能.最后通过挽救实验验证MKLP1esiRNA的作用特异性.实验显示MKLP1esiRNA转染HeLa细胞能够有效地特异性消除MKLP1的表达,并被异位表达的MKLP1所挽救.MKLP1蛋白在有丝分裂后期和末期前期位于纺锤体中间带,在末期后期和胞质分裂的最后阶段集中于中间体的中心处.MKLP1表达缺失使中间体正确形成和胞质分裂的完成受到严重抑制,造成大量双多核细胞堆积.结果表明,MKLP1在胞质分裂中间体形成和有丝分裂末期前期向后期过渡过程中起关键作用,是纺锤体中间体中间带相关蛋白,为胞质分裂所必需.     

外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置：胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和途径。     

七叶皂苷对P-糖蛋白功能的影响

目的:探讨七叶皂苷时P-糖蛋白功能的影响.方法:构建稳定表达P-糖蛋白的LLC-PK1细胞系,以real-time RT-PCR和Western Blotting分析P-糖蛋白基因mRNA和蛋白表达,共聚焦显微镜观察P-糖蛋白细胞定位,流式细胞术检测细胞内罗丹明123荧光强度.结果:(1)P-糖蛋白在LLC-PK1细胞中稳定高表达;(2)转染细胞中P-糖蛋白定位在细胞膜上;(3)七叶皂苷抑制P-糖蛋白功能.细胞内罗丹明123荧光强度增加123%,但其抑制效果是维拉帕米的30%.结论:七叶皂苷抑制P-糖蛋白功能,但其抑制效果弱于维拉帕米.     

金葡菌通过线粒体途径诱导U937细胞凋亡

目的探讨线粒体凋亡途径在金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）诱导人巨噬细胞系U937细胞凋亡中的作用。方法当细胞：细菌为1∶20时分别培养0 min,15 min,30 min,60 min和90 min,采用Western blot法检测胞质细胞色素C的表达及细胞内Bcl-2、Bax、caspase-9和caspase-3的表达。结果随着金葡菌感染时间的延长,胞质细胞色素C和Bax的表达逐渐增加;Bcl-2蛋白的表达逐渐降低;caspase-9和caspase-3的表达逐渐增加。结论金葡菌可通过抑制Bcl-2表达和促进Bax表达引起线粒体细胞色素C释放入胞质,激活caspase-9和caspase-3,促进U937细胞凋亡。     

鸡胚睾丸支持细胞的分离、纯化与鉴定

以18天鸡胚睾丸为实验材料,经胶原酶和胰蛋白酶两步酶消化法得到生精上皮细胞悬液.在原代培养过程中经差异贴壁和低渗处理后,获得了纯度约为90%的单层支持细胞.对纯化的培养物染色鉴定,结果显示支持细胞为碱性磷酸酶(AKP)阴性,而混杂在其中的另一种体细胞管周细胞为AKP阳性;油红O染色显示,支持细胞胞质内含有大量的脂肪滴,核内见双极小体;吖啶橙染色证实支持细胞富含RNA;罗丹明123染色显示支持细胞富含线粒体;Hoechst 33342染色显示支持细胞细胞核呈长卵圆形,核的长轴与细胞长轴平行;免疫荧光染色显示支持细胞胞质中表达波形蛋白.建立了一套简单、易行的鸡胚睾丸支持细胞分离纯化与鉴定方法.     

吐温80对体外HeLa细胞的杀伤抑制

研究吐温80对体外培养HeLa细胞的杀伤抑制。通过MTT法检测并观察了不同浓度吐温80、大肠杆菌内毒素(LPS)及前列腺素E1(PGEI)对体外培养HeLa细胞作用后细胞抑制率;将作用后细胞裂解液经SDS-PAGE及Western-blotting法测定其热休克蛋白70(Heat Shock Protein70,HSP70)表达。结果:0.02％吐温80具有明显杀伤HeLa细胞的作用,且作用后的HeLa细胞几乎无HSP70蛋白表达(正常HeLa细胞有一定量HSP70蛋白表达),但却有一种分子量为70kDa的蛋白高表达,表明吐温80显著抑制HSP70表达,以至HeLa细胞死亡,同时促使某一种蛋白大量堆积。大肠杆菌内毒素、前列腺素E1对HeLa细胞无明显抑制杀伤作用,且与吐温80无明显协同效应,同时亦对HeLa细胞HSP70表达无显著影响。推测:吐温80对HeLa细胞HSP70表达的显著抑制作用可能是其杀伤HeLa细胞的 作用机制之一,为理想的温热治疗肿瘤的协同合并作用药物,但其使细胞内大量某70kDa蛋白堆积现象有待进一步探讨。