海洋动植物共附生微生物的分离和抗菌活性研究*

从海参、海胆、海葵、海兔、石莼、羊栖菜、裙带菜分离得到125种共附生海洋微生物,以6种敏感菌为指示菌,从中获得具有抑菌活性的细菌21株,放线菌8株,真菌2株。21株抑菌海洋细菌中芽孢杆菌属为7株,占33.3%,弧菌属为11种,占52.2%,其余3株为假单孢杆菌属,占14.5%。8株抑菌海洋放线菌中链霉菌属为5株,占62.5%,小单孢菌属为3株,占36.5%。2株抑菌海洋真菌均为青霉属。     

海南西海岸红树林伴生植物内生放线菌多样性及其延缓衰老活性初筛

为寻找新型抗衰老药物,该文以海南西海岸红树林伴生植物为研究对象,采用9种不同培养基从7种伴生植物21份样品中分离纯化放线菌,通过PCR扩增,16S rRNA基因序列分析已纯化放线菌的多样性,利用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)模型筛选菌株来进行延缓衰老活性研究。结果表明:(1)从7种伴生植物21份样品中共分离到26株海洋放线菌,隶属于9科15属,分别为拟诺卡菌属、短状杆菌属、短小杆菌属、Demequina、戈登氏菌属、类诺卡氏菌属、Lysinimicrobium、细杆菌属、假诺卡氏菌属、微球菌属、原小单孢菌属、拟无枝酸菌属、Yimella、北里孢菌属和链霉菌属,其中链霉菌属为优势菌属。(2)经秀丽隐杆线虫模型筛选,发现有2株海洋放线菌的发酵粗提物具有延缓秀丽隐杆线虫衰老的作用。综上结果说明海南西海岸红树林伴生植物中含有丰富多样的药用放线菌资源,为海洋放线菌抗衰老研究奠定了基础。     

华西雨屏区不同恢复阶段湿性常绿阔叶林的土壤微生物多样性

采用时空互代的方法,探讨了崇州市鞍子河自然保护区和邛崃市天台山的常绿阔叶林自然恢复过程中土壤微生物数量、组成、区系和多样性变化,结果表明：（1）不同恢复时期土壤微生物数量存在显著性差异,在植被恢复5～40a期间,土壤细菌和放线菌的数量呈增加趋势,以恢复到40a植被土壤微生物总数、细菌和放线菌的数量较高,分别为1．06×10^6CFUg^-1干土、9．81×10^5CFUg^-1干土和6．8×10^4CFUg^-1干土;真菌以100a次生林较高,为9．01×10^4CFUg^-1干土;植被恢复中细菌占土壤微生物总数的79．06％～93．78％;真菌和放线菌数量分别占4．61％～11．24％和0．52％～15．38％;（2）不同恢复阶段土壤细菌和真菌数量大体上以夏季高,春、秋季较低;放线菌数量为春、秋季较夏季高;（3）植被恢复过程中,土壤微生物群落区系和优势种群组成不同,经鉴定有细菌10个属、真菌7个属、放线菌9个属,细菌以无色细菌属（Achromobater）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）和芽孢杆菌属（Bacillus）出现的几率较高;真菌主要是半知菌类和接合菌类,以木霉属（Trichoderma）、腐霉属（Pythium）、青霉属（Penicillium）和犁头霉属（Absidia）分布较为普遍;放线菌9个类群中8个属于链霉菌属（Streptomyces）,仅有1个类群属于小单孢菌属（Micromonospora）,以白孢类群（Albosporus）、金色类群（Aureus）和灰红紫类群（Griseorubroviolaceus）出现几率为较高;（4）细菌属的Shannon—Wiener指数、Simpson指数以恢复初期、30a生次生林和较原始植被为较高。在植被恢复5～50a期间,真菌和放线菌属的多样性呈波动性增加趋势,到50a达到最高;50a以后,呈下降趋势,表明植被恢复的30～50a土壤环境更适合真菌和放线菌的生长。     

拉鲁湿地自然保护区放线菌组成分析及生物活性测定

探究拉鲁湿地自然保护区的放线菌组成及其抑菌和酶活性,为放线菌新药物先导化合物和高活性酶的筛选提供资源。从拉鲁湿地自然保护区不同土壤类型、不同优势植被采集25份土样。用分散差速离心法分离了拉鲁湿地中温放线菌和低温放线菌。从中温放线菌中选择15株代表菌株进行了初步分类鉴定。采用打孔法检测了其对2株细菌和4株病原真菌的抑菌活性。结果表明：（1）拉鲁湿地放线菌数量从水生环境向陆地生态系统递增,中温放线菌数量显著多于低温放线菌;（2）拉鲁湿地土壤中分离到链霉菌属、小单孢菌属、诺卡氏菌属、马杜拉菌属、小链孢菌属5个放线菌属。其中以链霉菌属和小单孢菌属为优势属。链霉菌属以金色类群、白孢类群和粉红孢类群为主,小单孢菌分离到黄橙类群和黑褐类群;（3）供试菌株分解纤维素能力较强,分解蛋白质活性较低,具有抗菌活性的菌株很少,且抗菌活性较弱;（4）供试菌株耐毒性物质的能力较强。这些菌可用于毒害有机物污染物的处理。     

蜚蠊肠道抗真菌活性放线菌的筛选与鉴定

对美洲大蠊肠道具有抗真菌活性的内生放线菌进行筛选和分类鉴定。以白色念珠菌、红色毛癣菌、黑曲霉和烟曲霉4种人体致病真菌为研究对象,采用牛津杯法和菌株对峙共培养法对159株蜚蠊肠道内生放线菌进行体外抗真菌活性筛选,采用16S rDNA PCR、Blast同源性比对和构建系统发育树等方法对菌株进行分子生物学鉴定。研究结果表明,45株内生放线菌具有抗真菌活性,诸多菌株抗真菌谱较广,有10株内生放线菌对4种受试真菌均有拮抗作用。其中,链霉菌属为优势菌属有32株,占71.11%;戈登氏菌属有6株,微杆菌属有2株,分枝杆菌属、无色杆菌属、小单孢菌属、纤维微菌属和壤霉菌属各有1株。说明蜚蠊肠道含有丰富的抗真菌活性放线菌资源。     

波罗的海放线菌的多样性

摘要:【目的】为了探索海洋放线菌的多样性,为发现新的药物先导化合物提供新菌源,我们分析了波罗的海的放线菌多样性及生物活性。【方法】采集100 份底泥样品,用7 种培养基分离放线菌809 株;去掉相同菌株后,选择280 株代表菌进行了初步分类鉴定;采用琼脂扩散法,检测了它们对5 种细菌、真菌的抗菌活性;用API ZYM system 测定了21 种酶的活性。【结果】用海藻糖-脯氨酸培养基和HV 培养基分离的放线菌中,稀有放线菌占60% 和63% ;波罗的海的放线菌有15 个属,其中3 个属是首次从海洋中分离     

武陵山放线菌多样性

[目的]为了探究武陵山放线菌多样性,以便从新放线菌菌株中发现新的潜在药物先导化合物.[方法]从武陵山采集280份土样,采用纯培养的方法,用4种培养基分离到1134株放线菌.选择其中30株代表菌进行了初步分类鉴定;以3株细菌和7株农作物致病真菌作为指示菌,检测其抑菌活性;利用特异性引物扩增的方法,检测是否具有聚酮合酶(PKS Ⅰ、PKSⅡ)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因和多烯类化合物合成酶(CYP)基因.[结果]分离到的武陵山放线菌中,链霉菌占70%以上,还有小单孢菌等8个科13个属,其中有5个菌株是潜在的新种.选取的30株实验菌对细菌、真菌有不同程度的抗菌活性;其中含有4类化合物合成基因的菌株占23%～60%.[结论]武陵山原始森林土壤中,放线菌多样性很丰富,且存在很多未开发的稀有类群.有抑菌活性的菌株,可用于进一步的药物开发利用.     

白木香内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性

从白木香Aquilaria sinensis（Lour．）Gilg木质部的树脂形成部位和健康部位中共分离获得42株内生真菌,经初步鉴定,产孢的33株分属于3目4科7属,其余未产孢的9株暂归为无孢菌群。采用杯碟法和MTT法分别测定了各菌株的发酵上清液对3种病原菌的体外抑菌活性和2种肿瘤细胞的体外细胞毒活性。结果表明,白木香木质部健康部位内生真菌以枝顶孢霉属为优势属,而树脂形成部位的内生真菌种类比健康部位要多,且以青霉属为优势属。其中26株至少能抑制一种指示菌,占总数的61．9％;7株对指示瘤株具有细胞毒活性,占总数的16．7％。抑菌活性菌株主要分布在枝顶孢霉属和青霉属。枝顶孢霉属菌株抑菌活性较强,其抗菌活性成分值得进一步研究。     

块菌(松露)宿主可培养内生菌群落结构与多样性研究

探究四川凉山彝族自治州块菌主产区华山松内生菌群的结构及多样性。在会东县选取4个点(新田乡、新云乡、淌塘镇、雪山乡)的块菌宿主华山松的根、茎、叶为实验材料,通过不同培养基分离样品根、茎、叶的内生细菌、真菌、放线菌,DNA分子鉴定分离菌株的种属,最终分离得到细菌46株,其中欧文氏菌属(Erwinia)5株,沙门氏菌属(Salmonell)1株,杆菌属(Bacillus)22株,葡萄球菌属(Staphylococcus)2株,假单胞菌属(Pseudomonas)2株,类芽胞杆菌属(Paenibacillus)2株,布丘氏菌属(Buttiauxella)2株,肠杆菌属(Enterobacte)3株,爱文氏菌属(Ewingella)1株,泛菌属(Rahnella)1株,拉恩氏菌属(Rahnella Izard)2株,其他属3株;真菌19株,均为子囊菌门(Ascomycota),其中青霉属(Penicillium)4株,疱霉属(Phoma)1株,子囊菌门未知菌1株,篮状菌属(Cladosporium)1株,分枝孢子菌属(Sydowia)1株,曲霉属(Aspergillus)1株,其他属10株;放线菌33株,为链霉菌属(Streptomyces)22株,短小杆菌属(Curtobacterium)2株,短杆菌属(Brevibacterium)1株,其他属8株。研究结果表明,来自不同地点、不同植株部位、不同培养基分离得到的块菌宿主华山松内生菌有差异,证实微生物在土壤、块菌、宿主植物之间有着复杂的相互作用,为块菌的人工栽培提供参考。     

美洲大蠊肠道内生放线菌抗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性分析

昆虫肠道共生放线菌作为一种特境放线菌,因与土壤中的放线菌生存环境的不同,研究其种类和抗菌活性具有重要意义.将金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)这两种致病菌作为指示细菌,对分离自美洲大蠊Periplaneta americana肠道的159株内生放线菌使用牛津杯法实验,分别对其进行体外抑菌活性筛选,随后利用16S rRNA PCR、BLAST同源性对比和构建系统发育树相结合的方法对菌株进行分子生物学鉴定,对关键酶基因非核糖体多肽合成酶(Nonribosomal peptide synthetase,NRPS)基因、多聚酮合酶(Polyketone synthase,PKS)基因和卤化酶基因FADH2进行初步筛选.结果表明49株放线菌能够不同程度的抑制金黄色葡萄球菌和MRSA,有11株放线菌对两种致病菌均具有不同程度的抑制作用.49株放线菌中链霉菌属有36株(73.47％),属于优势菌属;其余的13株放线菌分别属于戈登氏菌属、微杆菌属、短状杆菌属、分枝杆菌属、无色杆菌属和小单孢菌属.琼脂糖凝胶电泳结果显示,11株放线菌中有6株放线菌均检测到关键酶基因PKS I、NRPS和卤化酶基因FADH2.本研究表明美洲大蠊肠道中含有具有抗菌活性的放线菌资源.     

Investigation of bacteria with polyketide synthase genes and antimicrobial activity isolated from South China Sea sponges

Aims:  To obtain bacteria with PKS (polyketide synthase) genes and antimicrobial activity from sponges.
Methods and Results:  Eighteen bacteria with KS (ketosynthase) genes were identified by polymerase chain reaction (PCR) screening of 98 isolates from South China Sea sponges, Stelletta tenuis , Halichondria rugosa , Dysidea avara and Craniella australiensis . 16S rRNA gene-based B last analysis indicated that 15 isolates belonged to the phylum Firmicutes , among which 14 isolates were closely related to genus Bacillus , and 1 to Staphylococcus lentus . Two isolates were identified as actinomycetes, and one as Alcaligenes sp. in the phylum Proteobacteria . The 18 KS domains belong to trans-AT type I PKS and match PKS of marine bacterial symbionts. The 18 bacteria exhibited broad-spectrum antimicrobial activities against fungi, gram-positive and gram-negative bacteria. A 21·8-kb PKS gene cluster fragment containing five modules was isolated from the Staphylococcus lentus isolate A75 by screening of a fosmid library.
Conclusions:  The PKS gene diversity and different antimicrobial spectra indicate the potential of bacteria associated with South China Sea sponges for diverse polyketide production.
Significance and Impact of the Study:  Combined with bioactivity assay the PKS gene-based approach can be applied to efficient screening of strains of pharmaceutical value and the prediction of related compounds.     

连作花生田根际土壤优势微生物的分离和鉴定

【目的】从不同连作年限的花生田根际土壤中分离优势微生物并进行鉴定,为研究花生连作后优势微生物的变化奠定基础。【方法】采用土壤稀释分离法从不同连作年限花生根际土壤中分离优势细菌、真菌和放线菌,结合菌株形态特征、培养性状、生理生化特征及16S rDNA序列分析对细菌、放线菌进行鉴定,通过形态特征、培养特征和分子鉴定方法对优势真菌进行鉴定。【结果】从连作花生田根际土壤中分离鉴定出7种优势细菌、7种优势真菌和7种优势放线菌。7种优势细菌分别为Leifsonia xyli、氯酚节杆菌(Arthrobacterchlorophenolicus)、黄色微杆菌(Microbacterium flavescens)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、巴斯德菌属(Pasteurella sp.)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。7种优势真菌分别为枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉有性型(Hypocrea lixii)、Exophiala pisciphila、微紫青霉(Penicillium janthinellum)、曲霉(Aspergillus sp.)和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。7种优势放线菌分别为紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、华丽黄链霉菌(Streptomyces flaveus)、Streptomyces panaciterrae、不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、假浅灰链霉菌(Streptomyces pseudogriseolus)、纤维素链霉菌(Streptomyces cellulosae)和金色链霉菌(Streptomyces aureus)。【结论】本研究是第一次系统的从连作花生根际土中分离鉴定优势微生物,种植花生后根际土壤中优势微生物的种类发生了明显变化,但变化没有规律。     

Phylogenetic analysis of mutualistic filamentous bacteria associated with fungus-growing ants

The attine ant-microbe system is a quadripartite symbiosis, involving a complex set of mutualistic and parasitic associations. The symbiosis includes the fungus-growing ants (tribe Attini), the basidiomycetous fungi the ants cultivate for food, specialized microfungal parasites (in the genus Escovopsis) of the cultivar, and ant-associated mu tualistic filamentous bacteria that secrete antibiotics specifically targeted to suppress the growth of Escovopsis. In this study, we conduct the first phylogenetic analysis of the filamentous mutualistic bacteria (actinomycetes) associated with fungus-growing ants. The filamentous bacteria present on 3 genera of fungus-growing ants (Acromyrmex, Trachy myrmex, and Apterostigma) were isolated from 126 colonies. The isolated actinomycetes were grouped into 3 distinct morphological types. Each morphological type was specific to the ant genus from which it was isolated, suggesting some degree of host specificity. The phylogenetic position of the 3 morphotypes was estimated using 16S rDNA for representative strains. The 8 isolates of actinomycetes sequenced are in the family Pseudonocardiaceae (Actino mycetales) and belong to the genus Pseudonocardia. Transmission electron microscopy examination of the actino mycete associated with the cuticle of Acromyrmex sp. revealed bacterial cells with an outer electron-dense membrane, consistent with actinomycetes in the genus Pseudonocardia. Ant-associated Pseudonocardia isolates did not form a monophyletic group, suggesting multiple acquisitions of actinomycetes by fungus-growing ants over their evolutionary history.     

小蓬竹根际土壤微生物及内生真菌多样性分析

为了解喀斯特典型物种-小蓬竹根际土壤微生物及不同部位内生真菌多样性,采用沿等高线等距离取样法采集小蓬竹根际土壤及健康植株,通过可培养对根际土微生物及内生菌进行分离,利用分子技术对其进行鉴定,根据鉴定结果构建系统发育树,并计算小蓬竹根际土壤微生物和根茎叶内生真菌多样性。结果如下：（1）共从根际土壤、根、茎、叶分离得到139个真菌菌株,隶属于27属,其中根际土壤分离得到34个真菌菌株隶属于12属,根部分离得到的63个内生真菌菌株隶属于17个属,茎部分离得到的14个内生真菌菌株隶属于8个属,叶部分离得到28个内生真菌菌株隶属于9个属;（2）根际土壤共分离得到41株细菌菌株,隶属于7个属26个种,20株放线菌菌株,隶属于1属15种;从Shannon-Wiener多样性指数、均匀度指数、Simpson指数排序来看,真菌主要表现为根 > 根际土壤 > 茎 > 叶,细菌和放线菌多样性均较低。（3）按层次聚类分析可分别将真菌、细菌、放线菌聚为3支。小蓬竹根际土壤、根、茎和叶具有丰富的微生物多样性,不同部位菌群组成存在差异性（P<0.05）,且存在以假单胞菌属、芽孢杆菌属等为优势属的抗盐耐旱菌群,这有助于揭示小蓬竹对喀斯特生境的适应性,以及为微生物-植物群落之间相互关系提供一定基础数据,为后期寻找小蓬竹相关耐性功能菌奠定基础。     

Degradation of vanillic acid and production of guaiacol by microorganisms isolated from cork samples

The presence of guaiacol in cork stoppers is responsible for some cases of cork taint causing unpleasant alterations to wine. We have performed a characterization of the cork-associated microbiota by isolating 55 different microorganisms: eight yeast, 14 filamentous fungi or molds, 13 actinomycetes and 20 non-filamentous bacteria. A screening for degradation of vanillic acid and guaiacol production showed that none of the filamentous fungi could achieve any of these processes. By contrast, five of the eight yeast strains isolated were able to degrade vanillic acid, although it was not converted to guaiacol. Guaiacol production was only detected in four bacterial strains: one isolate of Bacillus subtilis and three actinomycetes, Streptomyces sp. A3, Streptomyces sp. A5 and Streptomyces sp. A13, were able to accumulate this compound in both liquid media and cultures over cork. These results suggest that guaiacol-mediated cork taint should be attributed to the degradative action of vanillic acid by bacterial strains growing on cork.     

几种药用植物内生真菌抗真菌活性的初步研究

从三尖杉,南方红豆杉及香榧中分离出172株内生真菌,对其进行抗菌活性检测,结果表明共90株内生真菌对一种或多种植物病原真菌,如红色面孢霉（Neurospora sp.）,木霉(Trichoderma sp.）,镰刀菌（Fusarium sp.）等有抑制作用,来自三尖杉、南方红豆杉和香榧的抗菌活性菌株比例分别为40％,54.2%及57.1%。其中平板抑菌圈直径大于15mm的高抗菌株有35株。按Ainsworth等鉴定系统和方法进行鉴定,具有抗菌活性的内生真菌主要分布于心青霉属、镰孢菌属等18个属中。     

褐煤风化过程中微生物群落的演替

对采自辽宁省前屯煤矿的6种不同风化程度的褐煤样品进行扫描电子显微镜观察发现:刚采掘出来的褐煤表面几乎没有微生物存在.经5个月、1年及4年堆积风化的褐煤中也只见到休眠孢子和少量菌丝.将褐煤样品在潮湿状态下培养10天后,扫描电镜观察发现:刚采出来的褐煤及经5个月风化的褐煤表面有大量放线菌生长,而且菌落周围有褐煤被降解迹象.经1年风化的褐煤中除有大量放线菌及细菌生长外,真菌也有所增加.而在经4年风化褐煤中主要是真菌明显增加.平板计数结果同样说明褐煤风化过程中微生物存在演替现象:放线菌为褐煤初期降解的主要微生物,随后是细菌,在风化程度较高的褐煤中,真菌则为优势降解菌.三株优势放线菌为诺卡氏菌(Nocardia Sp.),束丝放线菌(Actinosynnema Sp.)和链霉菌(Streptomyces sp.).两株优势细菌均为节杆菌(Arthrobacter sp.).两株曲霉为栖土曲霉(A.terricola)及褚曲霉(A.ochraceous),为褐煤风化过程的优势真菌.     

青海高寒草甸土壤放线菌区系研究

2001～2002年从海北高寒草甸生态系统采集土样,用不同方法从中分离放线菌300余株,根据其形态和分类特征,分别归入小单孢菌属(Micromonospora)、诺卡氏菌属(Nocardia)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、原小单孢菌属(Promicromonospora)和链霉菌属(Streptomyces),并将链霉菌归入7个类群。同时对230株中温菌和110株低温菌的部分酶活性及其对真菌和细菌的拮抗性进行了测定,发现链霉菌不仅具有许多酶活性,而且对真菌和细菌有拮抗性。     

角额壁蜂共生放线菌分离、鉴定及其发酵产物抗菌活性研究

近年来,昆虫与共生菌的关系受到越来越多的关注,研究昆虫共生菌的种类及生物学功能具有重要意义。对从烟台、威海采集的角额壁蜂及其巢室进行放线菌的分离、纯化和16S rRNA序列测序并构建系统发育树,分别采用菌块对峙法和纸片扩散法测定菌株及其发酵液抗真菌和抗细菌活性。共计得到37株放线菌,鉴定结果表明共生菌菌株分别归属于7个属:链霉菌属26株,小单孢菌属3株,拟诺卡氏菌属2株,珊瑚状放线菌属1株,马杜拉放线菌属3株、假诺卡氏菌属1株和疣孢菌属1株。Streptomyces sp.OC1611-8A和Streptomyces sp.R1706-8菌体抗真菌作用较强,对杨生盾壳霉和云南刺盘孢抑菌圈直径更是达到了25~32 mm;Micromonospora sp.OC1403-4发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有较好的抗菌活性,抑菌圈直径达到了16~19 mm。本研究为进一步分离角额壁蜂共生菌的发酵产物,鉴定具有新型结构的抗菌化合物提供了参考。     

藏东南地区土壤放线菌的生态分布及活性研究

从藏东南原始森林、高山草甸、沼泽、粮田与保护地等不同植被、从2970~4590m不同海拔高度采集土样50份,用多种培养基分离中、低温放线菌,并对放线菌的数量、组成、生理生化特性以及它们的拮抗性等进行了研究。按放线菌的形态学特征进行了鉴定。结果表明:①从藏东南各种土壤中放线菌分离到9个属,其中束丝菌属在国内未见报道。以粮田中放线菌的数量和种类最多。②原始森林中拮抗性放线菌数量最多,提供了从原始森林土壤中可以筛选到更多拮抗性放线菌的重要信息。③抗革兰氏阳性细菌的放线菌菌株数较抗革兰氏阴性细菌的多,拮抗真菌的放线菌菌株数比拮抗细菌的多。④藏东南土壤链霉菌具有许多酶活性。