小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶基因(tmk)的分离、原核表达及酶活性分析

[目的]克隆、表达小麦蓝矮病(WBD)植原体胸苷酸激酶基因(tmk),并分析酶活性,进一步研究胸苷酸激酶在植原体感染宿主及繁殖过程中的功能和作用机理,更好地防治植原体病害.[方法]PCR方法扩增tmk基因并进行序列分析,连接pET30a( )表达载体后原核表达,经Ni-NTA柱层析纯化后进行酶催化活性分析.[结果]首次从小麦蓝矮病(WBD)植原体基因组中分离出胸苷酸激酶基因(tmk),该基因包含tmk-1和tmk-2两种,大小分别为630 bp和624 bp,其编码的氨基酸序列均包含3个与结合NTP/NMP相关的保守功能区.表达的融合蛋白TMK-1活性极低,酶活仅16.4 U/mg,而 TMK-2酶活高达112.41 U/mg,且其最适催化条件为32℃、pH 7.3、1.5 mmol/L Mg2 和 1 mmol/L ATP.[结论]分析了胸苷酸激酶活性中心的一级结构序列及其催化活性随条件变化而改变的性质,为深入研究小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶在侵染寄主及其在宿主体内增殖的转录性质奠定基础.     

桃儿七的经济价值及栽培技术

通过对桃儿七一年的栽培试验,就其观赏价值和药用价值作了初步探讨．提出了合理的栽培方法。     

禾谷缢管蚜体内的病毒结合蛋白基因的克隆与原核表达

利用一对特异性引物,用PCR的方法从禾谷缢管蚜体内扩增出了病毒结合蛋白基因,序列测定结果表明其长度 为1647 bp,编码548个氨基酸,与GenBank中的禾谷缢管蚜美国生物型Buchnera groELNT核苷酸序列同源性为97%,氨基酸同源性为97.4%。构建了2个原核表达载体并进行表达得到了69kD融合蛋白和63kD的非融合蛋白。     

壳寡糖诱导烟草对TMV长距离移动的影响

采用ELISA-DSM法和半叶枯斑法,测定了壳寡糖(50μg/mL)诱导后普通烟(Nicotiana tabacum)植株体内TMV浓度的变化.ELISA-DSM测定显示,在接种后10 d,仅在接种叶的上位叶和新生叶片中检测到病毒,且病毒浓度仅为不诱导对照的52.7%和38.8%,在下位叶中未检测到病毒;同时,接种叶内病毒增殖严重受抑,接种后10 d,病毒浓度仅为不诱导对照的23.52%.半叶枯斑法检测获得了相同结果,以壳寡糖处理植株的不同叶位的叶片为毒源,产生的枯斑数目都大幅度低于不诱导对照.以上结果证明,壳寡糖处理后TMV的上行和下行长距离移动均明显延迟和减少,下行移动受到的影响更大.透射电镜检查发现,处理植株接种叶的下位叶片韧皮部细胞中没有病毒晶体和病毒粒子,在上位叶片筛管伴胞中仅见少量病毒粒子,两者都未发现任何诱导新生物,也未见其他细胞结构变化.结果表明,壳寡糖处理使烟草对TMV病毒侵染产生了诱导抗病性,系统侵染症状明显减弱;壳寡糖处理对病毒长距离移动的不利影响可能是接种叶片病毒增殖减少所造成的.     

小麦蓝矮植原体染色体DNA的分离

[目的]分离小麦蓝矮(WBD)植原体染色体DNA,并建立WBD植原体染色体分离纯化体系.[方法]采用差速离心和脉冲电泳(PFGE)方法富集纯化WBD植原体染色体DNA,并通过PCR和Southern blot进行检测验证,实时荧光定量PCR方法对分离纯化效果进行定量检测.[结果]脉冲电泳凝胶中出现一条大小约为650 kb的条带,经PCR检测和Southern blot分析表明该条带为WBD植原体的染色体DNA.实时荧光定量PCR检测结果表明采用差速离心与脉冲电泳结合的方法可以将WBD植原体基因组的相对拷贝数提高436.5倍.[结论]采用差速离心与脉冲电泳法结合可以有效地从感染WBD长春花中分离到纯的WBD植原体染色体DNA,WBD植原体染色体DNA大小约为650 kb.     

玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因的克隆和原核表达

以玉米蚜杨凌生物型为材料,设计特异性引物采用PCR的方法在国内首先克隆了一种玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因,序列测定结果表明：玉米蚜杨凌生物型共生菌groEL奏长为1647bp,编码548个氨基酸,登录Genebank,序列号为AF387863。构建了该基因的原核表达载体,用pBV221表达出63KDa的非融合目的蛋白,用pET-3a表达出69KDa的融合蛋白,二者均有较高的表达量。     

麦二叉蚜体内病毒结合蛋白基因的克隆和原核表达

从麦二叉蚜体内克隆了一个DNA片段,经序列测定表明该片段全长为1647bp,编码548个氨基酸.与禾谷缢管蚜的病毒结合蛋白基因核苷酸同源性为92%,氨基酸的同源性为96%,从而认为这是病毒结合蛋白基因(GenBank登录号为AF434719).构建了该基因的原核表达载体pBVSG和pETSG,用pBVSG表达出63kD的非融合目的蛋白,用pETSG表达出69kD的融合蛋白,二者均有较高的表达量.以纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了此病毒结合蛋白的抗血清,用琼脂双扩散法测定效价为1∶512.     

玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因的克隆和原核表达

以玉米蚜杨凌生物型为材料,设计特异性引物采用PCR的方法在国内首先克隆了一种玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因,序列测定结果表明玉米蚜杨凌生物型共生菌groEL墓因全长为1647bp,编码548个氨基酸,登录Genebank,序列号为AF387863.构建了该基因的原核表达载体,用pBV221表达出63KDa的非融合目的蛋白,用pET-30a表达出69KDa的融合蛋白,二者均有较高的表达量.     

桃蚜体内与病毒结合的共生菌Buchnera groEL基因的克隆和序列分析

以桃蚜(Myzus persicae)杨凌生物型为材料,利用一对特异性引物,用PCR的方法从桃蚜体内扩增出了内共生菌的Buchnera groEL基因,序列测定结果表明其长度为1 647bp,与GenBank中的桃蚜荷兰生物型、蜿豆蚜(A-cyrthosi phonpisum)日本生物型Buchnera GroEL基因长度相同,同源性分别为99%和91%;Buchnera GroEL-YL编码548个氨基酸,序列比较发现与Buchnera GroEL-NT仅有3个氨基酸的差异,即AA111Met→Lys、AA222Val→Met and AA348G1n→His.     

柳树黄化病植原体的分子分类

[目的]柳树黄化病是一种重要的植原体病害,本研究旨在明确柳树黄化病植原体(Willow Yellow phytoplasma,WY)的分类地位,为进一步开展致病性和防治研究奠定基础.[方法]采用植原体特异引物通过PCR方法从患病植株DNA中扩增植原体16S rDNA基因和核糖体蛋白基因(ribosomal proteins gene,rp),对所得的序列进行分析,构建同源进化树,并用限制性片段长度多态性(RFTJP)对巢式PCR产物进行分析.[结果]首次从柳树黄化病植原体中分离出了16S rDNA基因和rp基因,大小分别为1246 bp和1212 bp.通过对植原体16S rDNA和rp基因的核苷酸同源性比较和RFLP分析,发现该分离物与16S rI组的核苷酸同源性均在99%以上,与16S rI-C亚组中的小麦蓝矮病植原体同源性高达99.8%(16Sr DNA)和99.6%(rp),且RFLP分析与16SrI-C亚组的植原体有相同的酶切条带.[结论]柳树黄化植原体应划分于16SrI-C亚组.